次世代シーケンサーによる小児骨髄異形成症候群と若年性骨髄単球性白血病の解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25461611
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 群馬県衛生環境研究所
• 研究代表者: 外松 学 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (70251113)
• 研究分担者: 林 泰秀 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (30238133) ; 大木 健太郎 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (50400966) ; 朴 明子 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (50450375)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子 / ゲノム / マイクロアレイ / 癌 / 臨床

研究概要

小児myelodysplastic syndrome(MDS)とjuvenile myelomonocytic leukemia(JMML)の発症分子機構を解明するために，小児MDS 40例とJMML40例を対象にし、これまでPTPN11、RAS、CBLなどの既知の遺伝子異常の解析および次世代シーケンサーを用いたターゲットリシーケンスによりRNAスプライシング関連遺伝子の解析を行ってきた。
今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17と最近成人の骨髄増殖性疾患(MPD)で話題になっているCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかった。CALR遺伝子の変異は血小板増多症 (ET) 21例中１例にみられたが、MDSとJMMLではみられなかった。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初めての症例である。
またダウン症候群のTAMからAMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、白血病への移行にはコヒーシン複合体(RAD21, STAG2, NIF, SMC1A, SML3)が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またTAM細胞を移植したNGOマウスの作整とiPS細胞樹立の基盤整備によりTAMから白血病への移行の機序の解明に貢献できた。これらによりTAMの診断の精度の向上と重症度の判定および治療薬の開発の基盤の確立を推進することができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

小児MDSとJMMLの発症分子機構を解明するために，これまで小児MDS 40例とJMML40例で既知の遺伝子異常の解析および次世代シーケンサーを用いたターゲットリシーケンスによりRNAスプライシング関連遺伝子の解析を行ってきた。
今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17と最近成人のMPDで話題になっているCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかった。CALR遺伝子の変異は血小板増多症(ET) 21例中１例にみられたが、MDSとJMMLではみられなかった。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初めての症例である。
またダウン症候群のTAMからAMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、白血病への移行にはコヒーシン複合体(RAD21, STAG2, NIF, SMC1A, SML3)が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またTAM細胞を移植したNGOマウスを４例で樹立し、遺伝子や染色体の解析を行い、さらにiPS細胞樹立の基盤整備によりTAMから白血病への移行の機序の解明に貢献できた。これらによりTAMの診断の精度の向上と重症度の判定および治療薬の開発の基盤の確立を推進することができた。

今後の研究の推進方策

エクソーム解析とターゲットリシーケンスについては、おおむね順調に進んだが、さらに多数例での新規に報告された遺伝子について検証を行い、臨床像との関係と機能解析を検討する。
１）標的遺伝子の同定と遺伝子性状の解析
解析した小児MDSとJMMLにおいてみい出された変異につき、次世代シーケンサーを用いて多数例でターゲットリシーケンスを行う。またheterodyplex mobility assay法、コロニーアッセイなどにより、腫瘍化との関連性のさらなる検証を行い、標的遺伝子の同定を試みる。並行して網羅的メチル化解析の結果より抽出した候補標的遺伝子に関しても同様の遺伝子の性状解析を行う。
２）メチル化の網羅的解析
メチル化の有無に関して網羅的に検討し、エピジェネティックな転写抑制機構の解明を試みる。検出されたメチル化領域に関しては、発現解析およびbisulfate sequencingによりvalidationを行い、さらに有用なものに関しては5-aza-deoxythidineによるin vitro assayも行う。

次年度の研究費の使用計画

平成25年度に小児MDS40例とJMML 40例の検討を行い、CALR遺伝子の変異はETの１例でみい出したが、CSF3R遺伝子の変異はみられなかった。ダウン症候群では既知の遺伝子に加え新規12遺伝子につきサンガーシーケンスにより検証を行い、新規遺伝子を同定し、その遺伝子を多数例でHiSeq2000とMiSeqを用いてターゲットリシーケンスを行っているところである。当初の計画よりMDSとJMMLの正常検体が入手できたのが少なかったこともあり、研究費503,537円を次年度の症例を検討するために先送りした。これらを研究予定なので、PCR、シーケンスの試薬を中心に平成25年度の先送りした研究費を合わせて次年度の研究費を使用する予定である。エクソーム解析のキットも購入する予定である。
平成25年度に小児MDS40例とJMMLの検討を行い、CALR遺伝子の変異はETの１例でみい出したが、CSF3R遺伝子の変異はみられなかった。CALR遺伝子変異について、さらに詳細に検討する予定である。ダウン症候群では既知の遺伝子に加え新規12遺伝子につきサンガーシーケンスにより検証を行い、さらに新規遺伝子を同定し、多数例でターゲットリシーケンスを行っているところである。当初の計画よりMDSとJMMLの正常検体が入手できなかったこともあり、研究費の一部を次年度の使用のために先送りした。次年度はさらに正常細胞を入手し、再発検体も検索してクローン進化についても検討を行う。また小児MDSとJMMLで標的遺伝子のうち５遺伝子につきターゲットリシーケンスを行い、小児AMLの原因遺伝子をみいだし、分子標的療法を開発するための分子遺伝学的基盤を構築する。

研究成果

• [雑誌論文] Liver disease is frequently observed in Down syndrome patients with transient abnormal myelopoiesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Park MJ, Sotomatsu M, Ohki K, Arai K, Maruyama K, Kobayashi T, Nishi A, Sameshima K, Takagi T, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 99 ページ: 154-161
  • DOI: 10.1007/s12185-013-1487-5
• [雑誌論文] Mutations of the GATA2 and CEBPA genes in paediatric acute myeloid leukaemia. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Funato M, Ohki K, Park MJ, Mizushima Y, Adachi S, Kobayashi M, Kinoshita A, Sotomatsu M, Arakawa H, Tawa A, Horibe K, Tsukimoto I, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Br J Haematol 巻: 164 ページ: 142-145
  • DOI: 10.1111/bjh.12559
• [雑誌論文] SETBP1 mutations in juvenile myelomonocytic leukaemia and myelodysplastic syndrome but not in paediatric acute myeloid leukaemia. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Ohki K, Park MJ, Sotomatsu M, Kudo K, Ito E, Sako M, Arakawa H, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Br J Haematol 巻: 164 ページ: 156-159
  • DOI: 10.1111/bjh.12595
• [雑誌論文] The landscape of somatic mutations in Down syndrome-related myeloid disorders. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Toki T, Okuno Y, Kanezaki R, Shiraishi Y, Sato-Otsubo A, Sanada M, Park MJ, Terui K, Suzuki H, Kon A, Nagata Y, Sato Y, Wang R, Shiba N, Chiba K, Tanaka H, Hama A, Muramatsu H, Hasegawa D, Nakamura K, Kanegane H, Tsukamoto K, Adachi S, Kawakami K, Kato K, Nishimura R, Izraeli S, Hayashi Y, et al.
  • 雑誌名: Nat Genet. 巻: 45 ページ: 1293-1299
  • DOI: 10.1038/ng.2759.
  • 査読あり
• [雑誌論文] WT1 mutation in pediatric patients with acute myeloid leukemia: a report from the Japanese Childhood AML Cooperative Study Group. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sano H, Shimada A, Tabuchi K, Taki T, Murata C, Park MJ, Ohki K, Sotomatsu M, Adachi S, Tawa A, Kobayashi R, Horibe K, Tsuchida M, Hanada R, Tsukimoto I, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 98 ページ: 437-445
  • DOI: 10.1007/s12185-013-1409-6
• [雑誌論文] NUP98-NSD1 gene fusion and its related gene expression signature are strongly associated with a poor prognosis in pediatric acute myeloid leukemia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Ichikawa H, Taki T, Park MJ, Jo A, Mitani S, Kobayashi T, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Adachi S, Tawa A, Horibe K, Tsuchida M, Hanada R, Tsukimoto I, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Genes Chromosomes Cancer 巻: 52 ページ: 683-693
  • DOI: 10.1002/gcc.22064
  • 査読あり
• [雑誌論文] Naturally occurring oncogenic GATA1 mutants with internal deletions in transient abnormal myelopoiesis in Down syndrome. (2013)
  • 著者名/発表者名: Toki T, Kanezaki R, Kobayashi E, Kaneko H, Suzuki M, Wang R, Terui K, Kanegane H, Maeda M, Endo M, Mizuochi T, Adachi S, Hayashi Y, Yamamoto M, Shimizu R, Ito E.
  • 雑誌名: Blood 巻: 121 ページ: 3181-3184
  • DOI: 10.1182/blood-2012-01-405746
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cytomegalovirus retinitis during maintenance therapy for T-cell acute lymphoblastic leukemia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Wakai K, Sano H, Shimada A, Shiozawa Y, Park MJ, Sotomatsu M, Yanagisawa R, Koike K, Kozawa K, Ryo A, Tsukagoshi H, Kimura H, Hayashi Y.
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 35 ページ: 162-163
  • DOI: 10.1097/MPH.0b013e318279e920
  • 査読あり
• [学会発表] Whole-Exome Resequencing Identifies Somatic Mutations Of BCOR and BCORL1 Transcriptional Corepressor Genes and Major Cohesin Complex Component Genes In Pediatric Acute Myeloid Leukemia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Ohki K, Nagata Y, Kon A, Okuno Y,Shiraishi Y, Kato M, Park MJ, Ohki K, Takita J, Kanazawa T, Kudo K, Ito E, Sanada M, Tomizawa D, Tawa A, Adachi S, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y.
  • 学会等名: 55rd Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: New Orleans
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] Low Frequency and Poor Prognosis Of MLL-Partial Tandem Duplications In Pediatric Acute Myeloid Leukemia Using MLPA Method: The Japanese Pediatric Leukemia/Lymphoma Study Group (JPLSG) AML-05 Trial. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohki K, Park MJ, Sano H, Hara Y, Shiba N, Tomizawa D, Taga T, Moriya Saito A, Fujimoto J, Tawa A, Horibe K, Adachi S, Hayashi Y.
  • 学会等名: 55rd Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: New Orleans
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] Whole Exome Sequencing Reveals Clonal Evolution Pattern and Driver Mutations Of Relapsed Pediatric AML. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Shiba N, Shiraishi Y, Shimada A, Terui K, Kato M, Okuno Y, Nagata Y, Kon A, Yoshizato T, Matsunawa, M, Chiba K, Tanaka H, Sanada M, Miyano S, Ito E, Hayashi Y, Ogawa S.
  • 学会等名: 55rd Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: New Orleans
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] Comprehensive Fusion Gene Analysis Of Pediatric Non-Down Syndrome Acute Megakaryoblasitc Leukemia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba n, Ohki K, Park MJ, Tomizawa D, Taga T, Saito A, Fujimoto J, Arakawa H, Tawa A, Horibe K, Adachi S, Hayashi Y.
  • 学会等名: 55rd Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: New Orleans
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] CSF3R Gene Mutations In Myeloid Malignancy Of Childhood. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sano H, Ohki K, Park MJ, Hara Y, Shiba N, Tomizawa D, Taga T, Moriya Saito A, Fujimoto J, Tawa A, Horibe K, Adachi S, Hayashi Y.
  • 学会等名: 55rd Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: New Orleans
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] 小児急性骨髄性白血病におけるGATA2遺伝子変異の解析.
  • 著者名/発表者名: 柴 徳生, 朴 明子, 舩戸道徳, 小林正夫, 木下明俊, 足立壮一, 荒川浩一, 多和昭雄, 月本一郎, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第116回日本小児科学会学術集会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] NUP98-NSD1融合遺伝子陽性例は小児急性骨髄性白血病において予後不良である.
  • 著者名/発表者名: 原 勇介, 柴 徳生, 嶋田 明, 工藤寿子, 富澤大輔, 多賀 崇, 多和昭雄, 荒川浩一, 足立壮一, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第116回日本小児科学会学術集会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] 小児B型前駆細胞型ALLにおけるCRLF2高発現例の特徴：TCCSG-ALL研究.
  • 著者名/発表者名: 大木健太郎, 朴 明子, 柴 徳生, 清河信敬, 康 勝好, 花田良二, 真部 淳, 菊地 陽, 小原 明, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第116回日本小児科学会学術集会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] 染色体異常を伴ったダウン症合併TAMとAMKLの遺伝子解析.
  • 著者名/発表者名: 朴 明子, 大木健太郎, 新井 心, 外松 学, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第116回日本小児科学会学術集会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] NUP98-MSD1 gene fusion is a strong poor prognostic factor in pediatric AML.
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba N, Shimada A, Kudo K, Tomizawa D, Taga T, Horibe K, Adachi S, Arakawa H, Tawa A, Hayashi Y.
  • 学会等名: 45th Congress of the International Society of Pediatric Oncology.
  • 発表場所: Hong Kong
• [学会発表] RNAシークエンシングによる小児AMLの融合遺伝子探索.
  • 著者名/発表者名: 三谷幸代, 坂本裕美, 柴 徳生, 林 泰秀, 吉田輝彦, 市川 仁.
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] 小児non-Down急性巨核芽球性白血病における遺伝子解析.
  • 著者名/発表者名: 原 勇介, 柴 徳生, 大木健太郎, 朴 明子, 富澤大輔, 多賀 崇, 足立壮一, 荒川浩一, 多和昭雄, 堀部敬三, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] NUP98-NSD1 gene fusion is a strong poor prognostic factor in pediatric AML.
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba N, Ichikawa H, Taki T, Shimada A, Kudo K, Tomizawa D, Taga T, Adachi S, Arakawa H, Tawa A, Hayashi Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Clonal architecture in a case of acute myeloid leukemia with trisomy 8 and MLL-AF9.
  • 著者名/発表者名: Ohki K, Kama Y, Shiba N, Arai K, Park MJ, Sotomatsu M, Hayashi Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Genetic basisi of myeloid leukemogenesisi in Down syndrome.
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Toki T, Okuno Y, Kanezaki R, Shiraishi Y, Sanada M, Park MJ, Terui K, Kon A, Nagata Y, Sato-Otsubo A, Sato Y, Wang R, Shiba N, Chiba K, Tanaka H, Hama A, Muramatsu H, Hasegawa D, Nakamura K, Kanegane H, Tsukamoto K, Adachi S, Kawakami K, Hayashi Y, Miyano S, Kojima S, Ito E, Ogawa S.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 13q欠失を伴ったダウン症合併TAMとAMKLの遺伝子解析.
  • 著者名/発表者名: 朴 明子, 吉田健一, 大木健太郎, 新井 心, 外松 学, 伊藤悦朗, 小川誠司, 林 泰秀.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Gata2 mutations are found in pediatric AML but not in other leukemias including JMML.
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba N, Funato M, Oki K, Park MJ, Mizushima Y, Adachi S, Kobayashi M, Kinoshita A, Sotomatsu M, Arakawa H, Tawa A, Horibe K, Tsukimoto I, Hayashi Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Whole-exome resequencing reveals novel pathogenetic gene mutations in pediatric AML.
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Yoshida K, Okuno Y, Shiraishi Y, Nagata Y, Kon A, Chiba K, Tanaka H, Ohki K, Kato M, Terui K, Park MJ, Kanazawa T, Takita J, Kudo K, Arakawa H, Ito E, Sanada M, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Recurrent SETBP1 mutation in juvenile myelomonocytic leukemia and myelodysplastic syndrome.
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Hara Y, Park MJ, Ohki K, Fukushima K, Sako M, Kudo K, Arakawa H, Ito E, Hayashi Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematolgy.
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 全エクソーム解析による小児急性骨髄性白血病の新規原因遺伝子の同定.
  • 著者名/発表者名: 柴 徳生, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第55回日本小児血液・がん学会学術集会（シンポジウム）
  • 発表場所: 福岡
• [学会発表] 小児白血病におけるSETBP1遺伝子変異の解析.
  • 著者名/発表者名: 柴 徳生, 大木健太郎, 朴 明子, 工藤寿子, 福島啓太郎, 伊藤悦朗, 迫 正廣, 多和昭雄, 荒川浩一, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第55回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 発表場所: 福岡
• [学会発表] 急性骨髄性白血病におけるWT1遺伝子変異の解析.
  • 著者名/発表者名: 佐野弘純, 嶋田 明, 田渕 健, 滝 智彦, 村田知里, 朴 明子, 大木健太郎, 外松 学, 足立壮一, 多和昭雄, 小林良二, 堀部敬三, 土田昌宏, 花田良二, 月本一郎, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第55回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 発表場所: 福岡
• [学会発表] 小児骨髄造血器腫瘍におけるCSF3R遺伝子異常の解析.
  • 著者名/発表者名: 佐野仁志, 大木健太郎, 朴 明子, 柴 徳生, 原 勇介, 外松 学, 足立壮一, 堀部敬三, 多和昭雄, 花田良二, 月本一郎, 林 泰秀.
  • 学会等名: 第55回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 発表場所: 福岡