| 研究課題/領域番号 |
25461632
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
森島 正恵 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (00241068)
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| 研究分担者 |
清水 一彦 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (90385394)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 循環器発生 / Foxc2遺伝子 / 肺発生 / 心肺前駆細胞 / 鰓弓動脈 / 肺微小循環形成 |
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| 研究実績の概要 |
我々はFoxc2 ノックアウトマウスを用い、鰓弓動脈の形成と胚胞・肺毛細血管の成熟におけるFoxc2 遺伝子の作用を解析し、心大血管発生と肺の分化成熟の関連性について検討を行っている。平成25年度においては器官形成期ミュータント胚における鰓弓形態の解析と免疫染色法により肺分化成熟度の解析を行い、Foxc2ミュータント胎仔においては肺胞形成が未熟で1型肺胞上皮が厚い傾向が認められること、器官形成期マウス胚では大血管および肺実質に分化した細胞ではFoxc2のシグナルが消失することを見出した。このため、平成26年度は発生過程における大血管および肺の形態的特徴を免疫組織学的手法のみならず､分子生物学的手技を用いて重点的に解析することを目的とした。
具体的には、関連が報告されている遺伝子のプローブを作成、RT-PCR で発現遺伝子の動態を確認後、免疫染色により発現部位を確認する作業を行った。ところが、wild typeおよびFoxc2+/- マウス胚仔において器官分化時に消失したFoxc2 遺伝子が妊娠後期胎仔肺では検出されることが判明した。このため、発現部位の同定を確認する必要が生じた。マウス胎仔において毛細血管内の赤血球がFoxc2抗体に強い非特異的反応を示すため、Foxc2-/- 胎仔所見と詳細な比較検討した結果、器官分化後に発達する付属リンパ管および血管平滑筋においてFoxc2陽性が確認された。最終的には、大血管および肺を形成するprogenitor細胞の移動様式を解析するためFoxc2陽性細胞（＝間葉系細胞）のfate mappingが不可欠と考えられ、現段階で可能なFoxc2ミュータントマウスにおける心肺原基のマーカー遺伝子の発現について解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究申請時には不明であった哺乳類心肺共通の前駆細胞がPengらに報告（2013年8月）されたことにより、研究計画の優先順位を変更する必要が生じてしまった。しかしながらFoxc2 遺伝子が肺の成熟への関与については我々が初めての報告であり、また計画の遅延はあるが、学会発表において再生医療研究をふまえ発生形態の専門としての詳細なデータを期待されているため、解析内容の確実さを重視するという意味ではおおむね順調な状況と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
Wild およびFoxc2+/- 胎仔肺のリンパ管、および血管中膜にFoxc2 発現が認められることから、本年度は心肺前駆細胞のマーカーとされる遺伝子を中心に､器官形成期Foxc2ミュータント胚仔の鰓弓形態形成と鰓弓動脈のリモデリング過程における血管の構築について分子生物学的手法（in situ hybridization, real time PCR等）を用いて解析を行い咽頭嚢の形態異常との関連、さらには血管壁およびリンパ管形成に関しても現在までのデータ補充を行いまとめる予定である。
今までの実験推移から､Foxc2陽性間葉系細胞の器官内の分布様式の解析、即ちFoxc2 lineage mapping の重要度がさらに増した。しかしながら、Foxc2遺伝子は器官形成期の間葉細胞に広く分布することから、特殊なCre-Loxp系のドライブとして使用する遺伝子改変マウスをデザインしなくてはならない。新しい遺伝子改変マウス（Foxc2-TmCre マウス）の作成を念頭に置き、Foxc2陽性心肺前駆細胞の存在部位の確認、第4-6鰓弓と肺原基への前駆細胞の分布について検討を進めているところである。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
RT-PCRによりWild およびFoxc2+/- 胎仔肺実質でFoxc2遺伝子が発現していたため、現在市販のFoxc2抗体を用いての発現部位確定に時間を要した。（今回、マウス胎仔の肺では特に非特異的反応が強い傾向が判明した）このため、Foxc2-TmCreノックインマウス作成への下準備が出来なかった。この予算枠が次年度使用額となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
発生後期のマウス胎仔リンパ管および血管中膜にFoxc2 発現が認められたことから、遺伝子改変マウス作成に向けて心肺前駆細胞のFoxc2ミュータント胚仔における分布様式の解析が、TmCre系におけるFoxc2遺伝子発現誘発時期特定の重要なポイントとなる。このため、今まで確認していなかった遺伝子マーカー（Isl-1やNkx2.5等）の抗体購入費、RNA プローブ作成に当てる。また、遺伝子改変マウスの準備も進める予定となっている。さらに、心肺前駆細胞に関するさらなる情報入手のため、循環器発生の最新データ発表の場であるWeinstein Conference （ボストン, USA、NIHおよびAHA助成）の参加旅費に充てる予定である。
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