| 研究課題/領域番号 |
25461649
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
岩井 正憲 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (80467993)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 新生児低酸素性虚血性脳症 / 内在性神経幹細胞 / 賦活法 / bFGF / EGF / 虚血障害部以内投与 / 神経再生医療 |
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| 研究概要 |
本研究は、仔ラット新生児低酸素性虚血性脳症(HIE)モデルに対し、basic fibroblast growth factor（bFGF)、およびepidermal growth factor（EGF)を虚血性脳傷害部位に投与することで、subventricular zone (SVZ) 及び虚血性脳傷害部位の内在性神経幹細胞を賦活化させ、神経組織保護、神経組織修復に及ぼす影響について検討し、同方法がHIEの治療に応用できる可能性について追求することを目的とした。
本年度は、HIEモデルに対して、bFGFおよびEGFを虚血性脳傷害部位に投与し、内在性神経幹細胞の賦活化と神経細胞新生効果及び神経学的機能回復効果の検討を行った。
日齢7に低酸素虚血負荷を行いHIEモデルを作成、日齢10に左頭頂骨に径1mmの孔をあけ、脳虚血部位を確認し、同部からハミルトンシリンジを挿入、虚血性脳傷害部位の2カ所にbFGFとEGFの注入を行った（治療群）。投与量は文献を参考に設定した。対照群には同容積のリン酸緩衝液の投与を行った。
HIE作成後7日の脳から作成した切片では、対照群に比べ治療群で、SVZおよび虚血性脳傷害部位でBrdU陽性の新生細胞とDCX陽性の神経前駆細胞は著しく増加していた。BrdU陽性の新生細胞数は、HIE作成後14日、28日を経過したSVZおよび虚血性脳傷害部位でも認められた。現在これらのBrdU陽性細胞が神経細胞に分化しているのかを、DCXおよびNeuN(成熟神経細胞マーカー）とBrdUの2重染色法にて解析している最中である。
また治療群および対照群において、神経学的行動評価をHIE作成後7日、14日、21日、28日に行い、結果を解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に実施を計画した、bFGFとEGFの投与部位、投与時期、投与量の設定は完了できた。
次にHIEモデルに対してbFGFおよびEGFを投与する治療群と、同量のリン酸緩衝液を投与する対象群について、HIE後7、14、28日に脳組織を取り出し、組織学的評価を行うために十分な切片を作成した。この切片はBrdU、DCX、NeuN、GFAP、NG2、APC、Iba1などの細胞マーカーの単染色および蛍光２重染色を行うために準備され、各単染色はすでに行われ、顕微鏡による評価中である。しかしながら、今年度の計画にあったBrdUと各マーカーによる蛍光２重染色による評価は、BrdUとDCX、GFAP、NG2、APC、Ibaは実施できたが、BrdUとNeuNは平成26年度への持ち越しとなった。
またHIEモデル対照群および治療群における神経行動評価は、実施、録画装置への記録はできたが、解析途中であり、残りは平成26年度へ持ち越しとなった。
以上の理由で概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度は、25年度に実施できなかったBrdUとNeuNの蛍光2重染色法による解析、および神経行動評価の解析を引き続き行う。
また26年度に実施予定としていた、虚血性脳傷害部位のグリオーシスに及ぼす影響について、アストロサイトのマーカーであるGFAPを用いて評価する。並びに、神経の再髄鞘化に
ついて、神経線維についてNF200を、オリゴデンドロサイトによる髄鞘についてmyelin basic protein (MBP)を各マーカーとした蛍光二重染色にて可視化し、その程度の変化について検討する。
次に、研究実施計画に挙げた通り、脳虚血障害中心部位から10μLの組織を吸引し、同部に含まれる神経幹細胞や神経前駆細胞を減少させることが、グリオーシスに対する影響を免疫組織化学法、神経行動解析にて評価する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
小児科医局の研究費管理補助業務担当者と、大学病院の調達担当の間で行き違いがあり、当初報告されていた予算残高を執行した後、3月27日に予算残高の間違いを通知されました。残された予算残高の執行には時間が無く、翌年度に繰り越しと致しました。
26年度の予算と合わせて、実験動物の購入、飼育費用、ならびに実験に必要な物品の購入に充てる予定です。
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