2013 年度実施状況報告書

I型コラーゲン転写活性化因子(COLF2)の精製とcDNAクローニング

研究課題

研究課題/領域番号	25461675
研究種目	基盤研究(C)
研究機関	獨協医科大学
研究代表者	籏持淳獨協医科大学, 医学部, 教授 (90172923)
研究期間 (年度)	2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード	I型コラーゲン転写活性化因子 / ヒトα1鎖I型コラーゲン遺伝子(COL1A1) / DNA エレメント / DNA‐アフィニティークロマトグラフィー / 真皮線維芽細胞
研究概要	私共はヒトα1鎖I型コラーゲン遺伝子COL1A1上流域のdeletion 解析を行っており、すなわちexonuclease IIIを用いたHenikoffの方法で転写開始点方向へのdeletionを-804より-332の位置までの種々の長さの(-804,-610,-517,-402,-332)欠失変異体キメラ遺伝子を作成、これを用いてルシフェラーゼアッセイ等の一過性発現実験でdeletion 解析を行い、-332から-402のDNA断片上に転写を上昇させるDNAエレメントが存在していることを明らかにした。そしてさらなるアッセイにより-386から-371に結合する因子の存在することを証明した。私共はこの因子をCOLF2と名付けた。この因子のコンセンサスな結合配列の予想をGenomatixMatinspector (Cartharius K et al:Bioinformatics21:2933-2942, 2005)で検索した結果、相同性の高い因子はなく、COLF2が新奇の因子である可能性が高いことが明らかにされた。そこで種々のsubstitution mutation を加えた断片を用いたGel mobility shift assay でcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることが次の大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要であるのだが、この部分での予備実験が予定どおり行かず、手こずっている状態である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由種々のsubstitution mutation を加えた断片を用いたGel mobility shift assay でcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることが次の大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要であるのだが、この部分での予備実験が予定どおり行かず、手こずっている状態である。ここを乗り越えることで研究は順調に進むと考えております。
今後の研究の推進方策	種々のsubstitution mutation を加えた断片を用いたGel mobility shift assay でcompetition assay などにより結合する配列を明確にする。ヒト真皮線維芽細胞を大量培養しlysate を作成する。そして合成オリゴDNA を用いたDNA‐アフィニティークロマトグラフィーで部分精製する。さらに高速液体クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどを用いてさらに精製する。その後精製した蛋白のペプチドシークエンスを行い、それを用いてcDNAクローニングを行う予定である。