| 研究課題/領域番号 |
25461675
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
籏持 淳 獨協医科大学, 医学部, 教授 (90172923)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | I型コラーゲン転写活性化因子 / ヒトα１鎖Ⅰ型コラーゲン遺伝子(COL1A1) / DNAエレメント / DNA‐アフィニティークロマトグラフィー / 真皮線維芽細胞 |
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| 研究実績の概要 |
私共はヒトα1鎖I型コラーゲン遺伝子COL1A1上流域のdeletion 解析を行っており、すなわちexonuclease IIIを用いたHenikoffの方法で転写開始点方向へのdeletionを-804より-332の位置までの種々の長さの(-804,-610,-517,-402,-332)欠失変異体キメラ遺伝子を作成、これを用いてルシフェラーゼアッセイ等の一過性発現実験でdeletion 解析を行い、-332から-402のDNA断片上に転写を上昇させるDNAエレメントが存在していることを明らかにした。そしてさらなるアッセイにより-386から-371に結合する因子の存在することを証明した。私共はこの因子をCOLF2と名付けた。この因子のコンセンサスな結合配列の予想をGenomatix Matinspector (Cartharius K et al:Bioinformatics21:2933-2942, 2005)で検索した結果、相同性の高い因子はなく、COLF2が新奇の因子である可能性が高いことが明らかにされた。そこで種々のsubstitution mutationを加えた断片を用いたGel mobility shift assayでcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることが次の大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要であるのだが、この部分での予備実験が予定通り行かず手こずっている状態である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
種々のsubstitution mutationを加えた断片を用いたGel mobility shift assayでcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることが次の大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要であるのだが、この部分での予備実験が予定通り行かず手こずっている状態である。ここを乗り越えることで研究は順調に進むと考えております。
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| 今後の研究の推進方策 |
種々のsubstitution mutationを加えた断片を用いたGel mobility shift assayでcompetition assay などにより結合する配列を明確にする。
ヒト真皮線維芽細胞を大量培養しlysate を作成する。そして合成オリゴDNAを用いたDNA‐アフィニティークロマトグラフィーで部分精製する。さらに高速液体クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどを用いてさらに精製する。次々年度はまず精製した蛋白のペプチドシークエンスを行い、それを用いてcDNAクローニングを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
種々のsubstitution mutationを加えた断片を用いたGel mobility shift assayでcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることがヒト真皮線維芽細胞を大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要で、この部分の予備実験が予定通りにいかず、先に進めず手こずってしまっているため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
まず種々のsubstitution mutationを加えた断片を用いたGel mobility shift assayでcompetition assay などにより結合する配列を明確にするために予備実験を成功させる。それから、ヒト真皮線維芽細胞を大量培養しlysate を作成する。そして合成オリゴDNAを用いたDNA‐アフィニティークロマトグラフィーで部分精製する。さらに高速液体クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどを用いてさらに精製する。その後、精製した蛋白のペプチドシークエンスを行い、それを用いてcDNAクローニングを行う予定です。これらの実験の際に必要となる培養用試薬やシークエンス用試薬やcDNAクローニング用試薬を大量に必要となるため昨年度の物品費の残額を今年度に当てて使用し研究成果を出していきたい。
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