| 研究課題/領域番号 |
25462152
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
神吉 佐智子 大阪医科大学, 医学部, 助教 (40411350)
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| 研究分担者 |
渡邊 房男 大阪医科大学, 医学部, 准教授 (40183719)
三重野 繁敏 大阪医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10411373)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 虚血性心筋症 / ホーミングペプチド / ペプチド創薬 / 培養細胞 |
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| 研究実績の概要 |
in vivo ファージディスプレイ法で見出したラット虚血心筋組織を標的とするペプチド配列を臨床で創薬に応用するべく、メカニズム解明を行った。まず、ペプチドの心筋組織での受容体分子を探索することとし、ラット心臓に虚血再灌流傷害を作成した。３０匹のラットから虚血再灌流傷害心筋を採取し、それらから組織破砕液を調整した。フェライトをPoly-glycidylmethacrylate樹脂で封入した直径200nmの微粒子であるFGビーズをアフィニティ担体として、虚血心筋組織破砕液に対してプルダウン法で受容体分子を結合させ質量分析で5種類の既知の受容体候補タンパク質が同定された。次いでこれらが、どのような機序でペプチドと結合するのかを培養細胞系で確認するため、in vitroで虚血状態を再現する方法を検討した。培養心筋細胞H9c2を用いた。低酸素培養は、無グルコース下にシアンを用い、シアン曝露時間に応じてATP産生量の低下を確認した。シアン除去により可逆的にATP産生は回復した。候補タンパク質の遺伝子を、緑色蛍光タンパクMiCyを付加したクローニングベクターにそれぞれ挿入し、これを培養心筋細胞に遺伝子導入し、蛍光色素の発現で遺伝子導入を確認した。ペプチドには赤色蛍光を付加し、低酸素培養条件下で蛍光共鳴エネルギー移動の観察を試みた。低酸素培養条件では、赤色蛍光を付加したペプチドの取り込みが認められず、培養心筋細胞では生体における虚血が再現できていないことが問題として確認された。このため、心筋細胞をストレッチチャンバーで培養することを試みたが、同様にペプチドの取り込みが認められなかった。次いで、培養心筋細胞に電気刺激を加えたが、これもペプチドの取り込みが認められず、現時点ではin vitro条件では生体で見られる虚血状態が再現できないことが示唆された。
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