| 今後の研究の推進方策 |
①免疫染色
APC+BrdU、NG2+BrdUの二重染色にて損傷後7,14,28,56日でカウントしOPC,オリゴデンドロサイト数の推移をみる。評価するtime point、サンプル数を増やし、オリゴデンドロサイト系の細胞生存・分化を経時的に評価する。
②電子顕微鏡
本年度もサンプルを作成し、電子顕微鏡での観察を行ったが、固定方法が確立せず評価を行える結果を得ることができなかった。次年度は固定法を含め再検討し、縦切片のサンプルを用い、トルイジンブルー染色で損傷脊髄の範囲を確認する。損傷範囲を、計算ソフトを用いて評価しA群、C群で比較する。また、電子顕微鏡で損傷周囲の拡大像を捉え、髄鞘の損傷程度や髄鞘形成を確認する。
③小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の他にオリゴデンドロサイトの分化過程にアミロライドが作用しているかどうかを確認する。正常脊髄においてオリゴデンドロサイト分化の促進因子(Sox10,MRF,Sip1,Nkx2.2,Olig1)や抑制因子(PDGFA/PDGFRα,Lingo-1)が関与していることが報告されている。これらの因子をRT-PCRやWetern blottingを用いて遺伝子・蛋白レベルでの変化を評価しアミロライドのオリゴデンドロサイト系細胞の分化への影響を比較する実験を検討している。
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