Smpd3の軟骨細胞肥大分化及びヒアルロン酸産生減少における機能解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25462376
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 栫 博則 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (50423728)
• 研究分担者: 前田 真吾 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (60353463) ; 小宮 節郎 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30178371) ; 石堂 康弘 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10300740)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: Smpd3 / 軟骨細胞 / BMP

研究概要

1) OA 軟骨、内軟骨性骨化過程、培養軟骨細胞分化系におけるSmpd3 の時間的・空間的発現プロファイリングを行った。a) マウス胎生17.5 日長管骨growth plateのSmpd3の免疫染色し、正常内軟骨性骨化過程の発現パターンを評価し、肥大軟骨層に多い事が分かった。b) 同様にHas2 の免疫染色を行い、仮説通りnSMase2 と発現が逆相関する事を確認した。c) ATDC5 細胞、C3H10T1/2 細胞、そしてマウス初代軟骨細胞のマウス軟骨細胞分化系と、ヒト正常軟骨細胞株C28/I2 を、BMP-2+ITS supplementsによる誘導系を用いて、それぞれmonolayer / micromass / pellet culture 系に分けて、経時的なSmpd3 mRNA とnSMase2 蛋白の発現パターンを、それぞれ定量的RT-PCR とウエスタンブロットでプロファイリングした。この時、Has2 発現も同時に解析し、やはりSmpd3/nSMase2 と逆相関する事を確認した。
2) Smpd3 の発現ベクター、アデノウイルス・レンチウイルス作製を行った。a) Smpd3 発現ベクターは、ATDC5 細胞の分化後期cDNA よりPCR 法でクローニングし、V5タグを付して作製した。これを基にアデノウイルス及びレンチウイルス発現ベクターに導入し、ウイルスを293A 及び293FT 細胞で産生・精製した。これをATDC5 細胞に感染させて、transgene 発現レベルを内因性Smpd3/nSMase2 と比較して評価した。
3) AktシグナルへのSmpd3の影響を評価し、Smpd3下流のセラミドがAktシグナルと軟骨細胞分化を抑制する事を示した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通りに実験を遂行し、データを蓄積出来ている。また、この中から、Smpd3下流のセラミドがAktシグナルと軟骨細胞分化を抑制する事を論文として報告出来た。

今後の研究の推進方策

ATDC5 細胞のsiRNA 実験系(siRNA はoff-target 効果を防ぐデザインをされた異なる４種類のカクテル)において、Smpd3 ノックダウンの軟骨細胞分化への影響を、分化マーカー(Sox9, Sox5/6, Col2a1, Col11a2, aggrecan, Col10a1, Mmp13)を分化段階毎に定量的RT-PCR 解析して評価する。またSmpd3 の誘導に重要とされ、かつ肥大軟骨細胞分化とそのマーカーCol10a1 の誘導に不可欠なRunx2 の発現への影響も、確認しておく。順次C3H10T1/2、C28/I2、マウス初代軟骨細胞でも同様に実験する。Smpd3 アデノ/レンチ・ウイルスを用いて逆の効果、すなわち肥大軟骨細胞分化抑制が得られるか解析・評価する。同時にHas2 発現を定量的RT-PCR とウエスタンブロットで、HA 発現はビオチン化HA 結合蛋白(HABP)を介して検討し、分化status とリンクしてSmpd3 の影響を受けるか確認する。Smpd3 機能を欠失したfro/fro マウスの軟骨ではアポトーシスの減少があり内軟骨性骨化が
遅れるので、Smpd3 が軟骨細胞のアポトーシスに促進的である事が示唆されるが、セラミドもアポトーシスを直接促進する事が知られているので、ノックダウンとGW4869 によるSmpd3/nSMase2 のloss of function と、ウイルス発現系とC2 ceramide によるgain of functionで、Smpd3-セラミド経路の軟骨細胞アポトーシスへの関与を明らかにしておく。

研究成果

• [雑誌論文] 6) BMP signaling upregulates neutral sphingomyelinase 2 to suppress chondrocyte maturation via the Akt signaling pathway as a negative feedback mechanism. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kakoi H, Maeda S, Shinohara N, Matsuyama K, Imamura K, Kawamura I, Nagano S, Setoguchi T, Yokouchi M, Ishidou Y, Komiya S.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 289 ページ: 8135-8150
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.509331
  • 査読あり
• [雑誌論文] 7) Human Immunodeficiency Virus Type I Enhancer Binding Protein 3 is Essential for the Expression of Asparagine-linked Glycosylation 2 in the Regulation of Osteoblast and Chondrocyte Differentiation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Imamura K, Maeda S, Kawamura I, Matsuyama K, Shinohara N, Yahiro Y, Nagano S, Setoguchi T, Yokouchi M, Ishidou Y, Komiya S.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 289 ページ: 9865-9879
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.520585
  • 査読あり
• [学会発表] BMPシグナルにより誘導されるSmpd3はセラミド-Akt経路を介して軟骨細胞分化成熟を抑制する (2014)
  • 著者名/発表者名: 前田 真吾、栫 博則、篠原 直弘、松山 兼寛、今村 勝行、河村 一郎、横内 雅博、石堂康弘、小宮節郎
  • 学会等名: 第27回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 京都府医師会館, 京都市
  • 年月日: 20140228-20140301
• [学会発表] BMP-2シグナルはneutral sphingomyelinase 2の誘導によるAktシグナル経路の抑制を介して軟骨細胞分化成熟を制御する (2013)
  • 著者名/発表者名: 前田真吾、栫博則、松山金寛、河村一郎、今村勝行、篠原直弘、永野聡、瀬戸口啓夫、横内雅博、石堂康弘、小宮節郎
  • 学会等名: 第３６回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸国際会議場, 神戸市
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Smpd3/nSMase2はセラミドを介したAktシグナル経路阻害によりATDC5軟骨細胞分化とヒアルロン酸合成酵素Has2の発現を抑制する (2013)
  • 著者名/発表者名: 栫博則、前田真吾、松山兼寛、今村勝行、河村一郎、篠原直弘、横内雅博、石堂康弘、小宮節郎
  • 学会等名: 第28回日本整形外科学会基礎学術集会
  • 発表場所: 幕張メッセ, 千葉市
  • 年月日: 20131017-20131018
• [学会発表] Neutral Sphingomyelinase 2 Is Increased During BMP-induced Differentiation of ATDC5 Chondrocytes to Suppress the Maturation as a Negative Feedback Mechanism (2013)
  • 著者名/発表者名: Shingo Maeda, Hironori Kakoi, Kanehiro Matsuyama, Katsuyuki Imamura, Ichiro Kawamura, Naohiro Shinohara, Masahiro Yokouchi, Yasuhiro Ishidou, Setsuro Komiya
  • 学会等名: The American Society for Bone and Mineral Rresearch 2013
  • 発表場所: Baltimore Covention Center, Baltimore, USA
  • 年月日: 20131004-20131007
• [学会発表] BMP シグナルがRunx2依存的に誘導するSmpd3/nSMase2は、セラミド・ シグナルによるAkt 経路の抑制によって軟骨細胞分化とHas2発現を抑制する (2013)
  • 著者名/発表者名: 前田真吾
  • 学会等名: 第１４回運動器科学研究会
  • 発表場所: ホテル・ヴィラフォンテーヌ, 東京都
  • 年月日: 20130913-20130914
• [学会発表] BMP signaling induces sphingomyelin phosphodiesterase 3 to suppress chondrocyte maturation and expression of hyaluronan synthase 2 in ATDC5 chondrocytes (2013)
  • 著者名/発表者名: Shingo Maeda, Hironori Kakoi, Kanehiro Matsuyama, Ichiro Kawamura, Katsuyuki Imamura, Naohiro Shinohara, Masahiro Yokouchi, Yasuhiro Ishidou, Setsuro Komiya
  • 学会等名: TGF-β meeting in Uppsala
  • 発表場所: Uppsala University, Uppsala, Sweden
  • 年月日: 20130530-20130602
• [学会発表] Smpd3/nSMase2 suppresses Akt signaling pathway to inhibit chondrogenic differentiation and expression of Has2 in ATDC5 cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Hironori Kakoi, Shingo Maeda, Ichiro Kawamura, Katsuyuki Imamura, Naohiro Shinohara, Masahiro Yokouchi, Yasuhiro Ishidou, Setsuro Komiya
  • 学会等名: 国際骨代謝学会・日本骨代謝学会 第２回合同国際会議
  • 発表場所: 神戸国際会議場, 神戸市
  • 年月日: 20130528-20130601
• [学会発表] Smpd3 prevents maturation and expression of hyaluronan synthase 2 in ATDC5 chondrocytes (2013)
  • 著者名/発表者名: Kakoi H, Maeda S, Imamura K, Kawamura I, Ishidou Y, Yokouchi M, Komiya S
  • 学会等名: ESCEO13-IOF Rome 2013
  • 発表場所: Rome Cavalieri, Rome, Italy
  • 年月日: 20130417-20130420