| 研究課題/領域番号 |
25462537
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
原口 貴裕 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (20457104)
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| 研究分担者 |
藤澤 正人 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30243314)
山口 耕平 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50457107)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | urocortin / sphingosine-1 / micro-TESE / 精子回収予測因子 |
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| 研究概要 |
1.免疫染色用のプレパラートの作成：urocortin,sphingosine-1の発現を組織レベルで確認するために、免疫染色用のプレパラートを作製した。Micro-TESEおよび、simple-TESE時に病理診断用に作成されていたブロックを用いて、新たに免疫染色用のプレパラートを作成した。作成したプレパラートは患者背景を含めデータベース化し、合計104症例の検体のデータベースを作製できた。
2.免疫染色の実施：先に作成したプレパラートを用いて、当初の計画通りurocortin,sphingosine-1の免疫染色を行った。特にurocortinの免疫染色に難渋したが、1次抗体の変更や蛍光免疫染色法への移行などを行うことにより、安定した染色が可能となった。免疫染色は現在も継続中であり、今後データベースと照合し解析を行っていく。
3.ヒト精巣検体を用いたcDNAの作成とデータベースの作成：男性不妊患者の同意の下、Micro-TESEの際に検体の一部を冷凍保存しておいた。この検体からmRNAを抽出し、RTによりcDNAを作製した。作成したcDNAは、免疫染色用プレパラートと同様に患者背景と共にデータベース化した。
4.分子生物マーカーの定量化：Real-time RT-PCR法を用いて、urocortinおよびspingosine-1のRNA定量化を行った。精巣内に含まれる量が微量であるため、測定誤差が生じやすく、1検体につき3回ずつ測定を行っており、現在も継続中である。また、理論的裏付けのため、生殖年齢の雄ラット精巣と抗癌剤投与によって不妊となったラットを用いてurocortineや関連タンパクの発現様式の変化について調べ、ヒト検体の結果との整合性を見ている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒト検体を用いる実験であり、検体量が少量であるためすべての工程を行うにあたり、ラットを用いた基礎実験を行ったのちに、手技が安定してからヒト検体での検討を行っている。また、urocortin,sphingosine-1ともに精巣内に存在する量が少量であるためPCRのプライマーやアニーリングの温度設定などに試行錯誤を繰り返したため予定より時間がかかっている。しかしながら、その中でも信頼できる検出方法を確立できたことは幸いであり、今後の解析に期待が持てる。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記のごとく、データベースの構築と免疫染色、PCRの手技は確立できたため今後は結果をデータベースに照合しながら解析を進めていく予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実験等に時間がかかり、予定していた物品等の購入ができなかったため。
次年度に物品等購入し、研究に使用していく予定である。
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