研究課題/領域番号 |
25462733
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研究機関 | 慶應義塾大学 |
研究代表者 |
樋口 明弘 慶應義塾大学, 医学部, 特任講師 (20383755)
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研究分担者 |
山崎 岳 広島大学, 総合科学研究科, 教授 (30192397)
向井 邦晃 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80229913)
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研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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キーワード | 局所合成ステロイドホルモン / シトクロムP450 / 涙腺 / 涙液分泌 |
研究概要 |
本研究は下記3項目に従って、涙腺における局所ステロイド産生を明らかにし、その生理的役割を解明するものである。 「1.涙腺における局所ステロイド合成活性測定法の確立」すでに確立した5α還元酵素活性測定系を応用して、トリチウムラベルされたステロイドを基質とし、HPLCを用いた酵素活性測定系を構築することにした。活性の高いデヒドロゲナーゼや還元酵素の活性は容易に測定できるため、まず、3β-ヒドロキシ-Δ5-ステロイドデヒドロゲナーゼ(3β-HSD)の酵素活性測定を目的とした。この酵素はプレグネノロンをプロゲステロンに変換し、各種ステロイドホルモン産生に必須である。この測定系を用いて、正常および性腺除去雄ラットの涙腺ミクロソームにおける3β-HSD活性を測定し、性腺除去によって活性が上昇することを確認できた。 「2.In vitro における涙腺組織による涙液産生測定系の確立および産生に対するステロイドの影響の検討」雄ラット涙腺を摘出して培地中37℃でインキュベーションし、培地中へのリゾチーム分泌を検討した。リゾチーム濃度の測定は、リゾチーム酵素活性を測定することにより可能となった。摘出した涙腺をメスでスライス状にして培地に入れ、インキュベーション前後のリゾチーム濃度を測定したところ、測定は可能であったが、サンプルごとのばらつきが大きいことがわかった。実験系に関する改良が必要であると思われる。 「3.ドライアイモデルにおけるステロイド産生」免疫組織染色法を用いて、涙腺中ステロイドホルモン合成系酵素の局在を明らかにすることができた。雄雌ともに大部分の酵素は腺房ではなく導管に局在しており、効率的なステロイド合成が行われていること考えられた。また、アンドロゲン受容体は涙腺全体に存在し、涙腺機能がアンドロゲンによって調節されていることが示された。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、目的達成のために下記3項目の小目的を掲げ、研究を推進している。項目ごとに達成状況を検討する。 「1.涙腺における局所ステロイド合成活性測定法の確立」新しく涙腺ミクロソーム3β-HSD活性測定系を構築することができた。また、現在17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(17β-HSD)活性測定系の構築を進めており、予備検討により活性測定が可能であることが示された。この酵素はアンドロステンジオンをテストステロンに変換する酵素であり、アンドロゲン産生に必須である。アンドロゲンが涙腺機能調節に重要であることから、タバコ主流煙曝露モデルのような涙腺機能障害モデルにおいて活性変動が期待できる。しかしながら、P450の活性測定に関しては未だ成功していないため、他の方法を検討する必要がある。 「2.In vitroにおける涙腺組織による涙液産生能測定系の確立および産生に対するステロイドの影響の検討」涙腺組織ホモジェネート上清および培地中リゾチーム濃度の測定系を確立した。リゾチームは涙液中タンパク質の30%を占める主要タンパクであり、涙腺における涙液産生、分泌のマーカーとして非常に適している。しかしながら、同じ涙腺から調製し、組織重量を補正したサンプル間で大きなばらつきが認められたことから、現状では分泌機能マーカーとして用いることはできない。また、同じく主要タンパクであるラクトフェリンも涙腺機能マーカーとして考えられるため、ラクトフェリンのEIA測定系を確立中である。 「3.ドライアイモデルにおけるステロイド産生」免疫染色法により、涙腺中ステロイドホルモン合成酵素の局在を明らかにした。酵素の局在は雌雄間で大部分は同じであったが、P45017αのように差があるものも認められた。涙腺組織免疫染色法の確立により、ドライアイモデルと正常個体との比較検討が可能となった。
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今後の研究の推進方策 |
本研究は目的達成のために下記3項目の小目的を掲げ研究を推進している。以下に項目ごとに研究推進方策を記載する。 「1.涙腺における局所ステロイド合成活性測定法の確立」ステロイド合成系の中では比較的酵素活性の高い、3β-HSDなどのデヒドロゲナーゼ、還元酵素の活性測定は可能となったが、P450の活性測定は困難なままである。免疫組織染色の結果から、大部分のステロイドホルモン合成酵素は導管に局在していることが明らかとなった。そこで、涙腺全体ではなく導管のみを分離し、組織を用いた活性測定あるいは導管よりミトコンドリア、ミクロソームを単離し、これらを用いた活性測定を実施する。また、異なるアプローチとしてLC-MS法を用いて、涙腺中の各種ステロイド濃度を測定し、濃度から各酵素活性を推定する。 「2.In vitroにおける涙腺組織による涙液産生能測定系の確立および産生に対するステロイドの影響の検討」現状ではリゾチームは涙腺産生機能マーカーとして用いることは可能であるが、涙液分泌機能のマーカーとしては用いることができない。これはサンプル調製法に問題があると考えられるので、涙腺サンプルの切り出し法の調整、切り出したサンプルの厚みの均一化、円筒型メスを用いたくりぬき法、などを組み合わせ、均一なサンプルを調製して測定に用いる。またリゾチーム以外にラクトフェリンをマーカーとして用い、安定した涙液産生、分泌測定系の確立を目指す。 「3.ドライアイモデルにおけるステロイド産生」ステロイドホルモン合成に関与する各種酵素の免疫染色が涙腺において可能となった。リアルタイムRT-PCR法および免疫組織染色法を組み合わせて、タバコ主流煙曝露によって機能低下した涙腺と正常ラット涙腺を比較検討することにより、涙腺機能に対する局所ステロイドホルモン合成系の関与を調べる。
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次年度の研究費の使用計画 |
ドライアイモデルであるラット主流煙曝露モデル作成のためのタバコおよびライター、コネクターなどの周辺消耗品購入のための経費と予定していたが、動物実験が効率的に実施できたために、予想より経費がかからなかった。 ラット主流煙曝露モデル作成のためのタバコおよび周辺消耗品購入に使用。
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