| 研究課題/領域番号 |
25462739
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
宗正 泰成 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (30440340)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 網膜 / アポトーシス |
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| 研究概要 |
①TLR4の発現細胞の同定: 免疫組織化学染色によると、TLR4はマウス視神経挫滅１日後Iba1陽性マイクログリア及びThy-1陽性網膜神経節細胞に発現していた。②TLR4のligandの同定：視神経挫滅後、網膜膜蛋白抽出後、TLR4抗体によるImmunoprecipitationを行い電気泳動施行後Silver stain施行し、目的分子部位(TLR4)のMass Spectrometry (MALDI-TOF MS)により相互分子を確認した。HistoneH2B type1-Bが検出された(Score229)。③TLR4とHistoneH2Bの蛋白質間相互作用の分子生物学的評価：pEGFP-N3 vector を制限酵素のEco RI 及びBam HI で切断し、TLR4をPCRで増幅後、cDNAを精製しpEGFP-N3 vectorに挿入し、EGFP-TLR4 plasmid DNAを作成した。大腸菌にTLR4 plasmid DNAを用いてTLR4を強制発現させその後TLR4を精製する。そしてHis tagを融合したHistoneH2Bを用いて Pull downを行いImmunoblotでその相互作用を確認した。His tag Histoneでpull downしimmuno blotをHistoneH2BとTLR-4で行いTLR-4とHistoneH2Bの相互作用を確認した。④HistoneH2Bの細胞障害評価：wild miceにHistoneH2Bを投与すると、control群に比し約30％細胞死が生じる。TLR-4 knock out miceではcontrol群と比較してHistone投与群では有意差生じなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ほぼ計画どおり実施できているが、HistoneH2bの細胞外基質内での評価が困難である。量が少ないのと細胞外基質のみ網膜から抽出することが困難であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
HistoneH2B投与後TLR-4を介した細胞死の下流の機序について生化学的実験による追求を必要とする。虚血も関与しており虚血発生機序についても検討する必要がある。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
knock out miceの飼育の運用費用が予想より低額で行われた。細胞外基質採取が成功せずHistoneH2BのElisaのkitを購入していない。Plasmid作成が順調にいき、試薬の追加購入の必要性がなかった。
今後TLR-4を介した細胞死の下流を生化学的実験にて証明する。また可能ならHistoneH2B ヘテロマウスを用い実験を試みたい。
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