| 研究課題/領域番号 |
25462747
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| 研究機関 | 岩手大学 |
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研究代表者 |
菅野 江里子 岩手大学, 工学部, 特任准教授 (70375210)
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| 研究分担者 |
村山 奈美枝 岩手大学, 工学部, 学術研究員 (60597516)
砂金 ひとみ 東北大学, 大学病院, 助手 (30400451)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 眼科学 / オプトジェネェティクス / 視細胞変性 / 網膜神経節細胞 |
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| 研究概要 |
アデノ随伴ウイルス2型（AAV2）のベクターに赤方型チャネルロドプシン(mVChR1)と光応答性クロライドイオンチャネルであるハロロドプシン（NpHR）を組み込んだ。既存のクラミドモナス由来のチャネルロドプシン2 （ChR2）を発現させるAAV2型を含め、全ての遺伝子は可視化するために、蛍光タンパク質VenusまたはCherryと融合発現させるようデザインされた。このプラスミドを用い、AAV2型ウイルスを作製した。また、AAV2型及び8型の細胞への透過性を高めた改変型（AAV2M及びAAV8M）を作製した。
AAV2-ChR2またはその2型および8型の改変体をノーマルな視機能を有するSDラットと視細胞変性モデルであるRCSラットの硝子体へ投与を行った。その結果、RCSラットでは遺伝子発現効率がSDラットと比較し、顕著に高い事が認められた。また、RCSラットにおいてAAV2M型で高い発現が認められた。更にAAV2型では投与部位にその発現の偏りがみられたのに対し、予想通りAAV2M型では全域に広がっている事が認められた。以上の事からAAV2M型は広範囲への遺伝子導入には適していると考えられる。今回は網膜伸展標本で解析を行ったが、今後、凍結組織標本を用いて網膜での局在を確認する予定である。また、2M型でRGCsへの特異性が高く見られた場合には、AAV2M-ChR2とAAV2M-NpHRの組み合わせ、及びAAV2M-mVChR1とAAV2M-NpHRの組み合わせで投与を行い、各遺伝子の発現を凍結網膜組織標本を用いて調べる。更に同時にVEPの反応を様々な波長光を用いて測定する。対照としては、AAV2M-ChR2のみを遺伝子導入した群を用いる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画では、網膜組織標本での遺伝子発現の局在を確認している予定であったが、得られた遺伝子の既報告との相違及び、動物の入手や投与の時期の関係で実験結果を得るために時間が必要となった。しかし、必要であるコンストラクションの作製等は順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
AAV2M-ChR2とAAV2M-NpHRの組み合わせを用いた場合と、AAV2M-mVChR1とAAV2M-NpHRの組み合わせを用いた場合で投与を行い、各遺伝子の発現を確認する。そして、その発現局在について凍結網膜組織標本を用いて明らかにしたい。更に同時にVEPの反応を様々な波長光を用いて測定する。対照としては、AAV2M-ChR2のみを遺伝子導入した群を用い、これまでのChR2による視覚機能再建とどちらが応答に優れているか検討を行いたい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ベクターの構築に時間を要した。NpHRの遺伝子の配列が既知の情報と異なっており、得られた遺伝子ではコードするアミノ酸も異なる為、2種類のパターンを作製した。更に、動物の入手や投与する時期の問題により、本年度行う予定であった実験の一部を次年度に行う予定である。
新たに投与するRCSラットの購入費用及び動物飼育に関する費用が必要である。更に電気生理試験に関わる費用とウイルス作製に関わる試薬費用が必要である。
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