| 研究課題/領域番号 |
25462760
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
毛塚 剛司 東京医科大学, 医学部, 准教授 (00287137)
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| 研究分担者 |
松永 芳径 東京医科大学, 医学部, 助教 (20421050)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎 / マウス実験的自己免疫性視神経炎 / アストロサイト / 視神経脊髄炎 |
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| 研究概要 |
AQP4 抗体陽性かつステロイドパルス療法不応例である視神経脊髄炎（NMO）患者症例から、血漿交換療法時に発生した廃棄血漿を患者の同意の下に回収し、IgG 分画の抽出精製した（東京医科大学倫理委員会承認番号1971）。
１．NMO 血漿のアストロサイトへの障害の検討 -in vivo モデル作成- C57BL6/J マウスを用いて、ミエリン蛋白（MOG35-55）を強化検疫し、(300μg/匹) 同時に百日咳トキシン(100μl/マウス)を腹腔内投与し、EAE-EAON（実験的自己免疫性視神経炎モデル）を作成した。患者血漿をIgGカラムNMO-IgG をマウスに免役する2 日前から2 回、100mg/匹の割合で腹腔内投与した。免疫14 日目にマウスを屠殺して、視神経のアストロサイトの障害をH-E 染色で確認するのと同時に、GFAP 染色で評価した。また視神経炎に対して、OptomotryTM で視力測定を行い、臨床的にスコア評価を行ったところ、NMO-IgG投与マウス群で視力の低下が認められた。
２．NMO-IgG のマウスアストロサイトの反応性を検討 -in vitro モデル- NMO-IgG 内に抗AQP4 抗体が含まれているため、NMO-IgG はアストロサイト上に存在するAQP4 を認識することが予想される。このため、大脳皮質由来のアストロサイトを新生児マウスより単離し培養して、アセトン固定後に以下の抗体と反応させ、免疫染色法で評価した。結果は、実験群（アストロサイト: GFAP-FITC （マウス由来）＋抗ヒトIgG 抗体）においてアストロサイト上のAQP4と反応し、染色されることを確認した。培養上清サイトカインをELISA、フローサイトメトリーを用いて測定したが、有意なサイトカイン上昇は得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
概ね実験計画は順調に進展しているが、in vitro実験におけるアストロサイトからのサイトカイン産生がうまく検出されていない。今後、培養上清からのサイトカイン測定を再検討するにあたり、アストロサイトに対するmitogenによる刺激が必要になると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
プロジェクトの次年度である平成26年度は、ex vivo モデルの作製とNMO-EAON（マウス視神経炎モデル）に対する高濃度IgG 投与実験をex vivo モデルやin vivo モデルを用いて解析する。
・NMO-IgG のアストロサイト障害性の検討 -ex vivo モデル-
具体的には、マウス視神経を採取したのち24 時間, 酸素化した培養液内に加えて培養を行う。評価としては、アストロサイトの障害の程度をGFAP 染色を用いて病理組織学的に行う。使用抗体は、アストロサイトの染色として GFAP 染色などを用いる予定である。
・NMO-EAON のex vivo、in vivo モデルを用いた高濃度IgG 投与による発症抑制実験
具体的には、NMO-EAON のex vivo モデルを昨年度の方法で作成して、視神経組織の培養下でヒトIgG0.5-1.0mg/ml＋ヒトNMO-IgG＋補体を加えて、組織の変化を解析する。組織染色はアストロサイトの生存率を中心に検討する。また、可能なら培養上清中のサイトカイン測定をELISA、フローサイトメトリーを用いて行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当該年度末（3月）に予定していた実験計画が延期になり、また論文査読に関わる費用請求が4月にずれたために次年度使用額が生じた。
平成26年4月以降に3月に計画していた実験および論文査読を行うために使用する予定である。
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