| 研究課題/領域番号 |
25462782
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
吉田 篤史 川崎医科大学, 医学部, 講師 (10363219)
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| 研究分担者 |
植村 貞繁 川崎医科大学, 医学部, 教授 (40160220)
久山 寿子 川崎医科大学, 医学部, 助教 (90548645)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | iPS cell / tissue engineering / smooth muscle / gut / activin A |
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| 研究実績の概要 |
平成25年度までの研究で、未分化で分化多能性を保ち、純度の高く均一なマウスiPS細胞の継代培養量産方法がフィーダーフリーの環境下でほぼ確立できた。
平成26年度は、次の分化誘導ステップを中心に行った。いかなる臓器も3次元構造を形成していることから、まず胚様体形成法を用いる必要がある。胚様体はES細胞あるいはiPS細胞から作製される球状の構造物であり、一見どれでも同じようにみえるが、その作製条件により、最終的に分化誘導される組織が異なる。胚様体を形成する因子は１）細胞数、２）培養容器、３）培養液、成長因子など多岐にわたるため、腸管への分化の至適条件を探索する必要があり、これらの条件の試行錯誤を繰り返した。
１）細胞数に関しては、さまざまな数を試したが、1胚様体あたり500-1000個が至適のようである。２）は懸垂法ではなく、低接着性の丸底U字プレートや、量産用に300以上のウェルのあるマイクロアレイプレートを用いてデータを集積した。３）成長因子に関しては、これまでに解明された内胚葉系の分化においてActivin A, bFGFが有用であることが知られており（Development 2004; 131: 1651-1662、Annu Rev Cell Dev Biol 2009; 25: 221-251）これらの使用に加え、腸管蠕動を司る神経への分化誘導を期待して、BDNF,FGF10, BMP-2などの因子を試した。
現時点で腸管様構造物となる効率的な培養条件は明らかではないが、さらに培養条件、容器、接着基剤を変えて追及していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成25年度の成果として、未分化で分化多能性を保ち、純度の高く均一なマウスiPS細胞の継代培養量産方法がフィーダーフリーの環境下でほぼ確立できた。
現在、次のステップとして胚様体形成法を用いて、腸管への分化誘導を行っているが、その作製条件により、最終的に分化誘導される組織が異なる。胚様体を形成する因子は１）細胞数、２）培養容器、３）培養液、成長因子など多岐にわたるため、3胚葉由来である腸管臓器への分化の至適条件の同定には、まだまだ条件の試行錯誤を繰り返す必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
臨床的に使用できる人工腸管はこれまで世界でも誰も成功していない大変難しい分野であるが、我々は、ごく小さいものの蠕動する平滑筋シートの作成に成功しており、胚様体を用いて、ある一定の進歩は得ている。
iPS細胞を用いた研究では心臓、神経、網膜、膵臓β細胞の作成が進んだ分野であるが、これらの誘導技術からヒントを得て、打開策を見出すことで対応する。具体的には腸管上皮が内胚葉由来であるので、膵臓あるいは肝臓への分化誘導法一部使用して、分化誘導される各段階をPCRを用いて追跡し評価していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
3年目にあたる平成27年度は、最後の年度として平成25、26年度に生成した細胞の客観的評価を主に行うために、新たに抗体、試薬など高価なものを多く購入する必要があるため、平成26年度の支出は、実験物品は厳選してできるだけ繰り越すような方針としていた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は平成27年度請求額と合わせ、細胞、培地、成長因子、培養容器に加え、分化誘導物の評価のために、リアルタイムPCR,蛍光抗体法のための抗体、試薬を揃える予定である。
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