| 研究課題/領域番号 |
25462832
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
中村 明夫 帝京大学, 医学部, 講師 (70266287)
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| 研究分担者 |
宮川 誠 帝京大学, 中央動物実験施設, 教務職員 (80398734)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | β２アドレナリン受容体 / 敗血症 / 副腎皮質ステロイド薬 / エピジェネテイクス |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、腎臓のβ２アドレナリン（β２AR）を活性化させグルココルチコイド（GC）を投与する治療方法が敗血症腎傷害に伴うＧＣ抵抗性の病態改善に有効かどうかを細胞内と生体内から検証することである。本年度は、検体の採取と、その検体からＧＣ抵抗性の病態の一つであるヒストンアセチル化現象への本治療方法の効果を調べる実験を実施した。
１．検体の採取
（１）細胞内分子レベルでの評価：ラット腎臓由来のマクロファージと尿細管上皮細胞の培養細胞を用い、アデノウイルスをベクターとしたβ２AR遺伝子を培養細胞に導入しβ２ARを活性化状態にした。この細胞にＬＰＳあるいはグルココルチコイド（GC）を投与し、それぞれ細胞および上清サンプルを採取した。（２）生体内反応レベルでの評価：腹膜炎敗血症モデルラット（盲腸結紮1回穿刺法）に、アデノウイルスをベクターとしたβ２AR遺伝子を腎臓に直接導入することで腎組織内のβ２ARを活性化した。このβ２AR活性化状態にしたラット、あるいは活性化させないラットにグルココルチコイド（GC）を投与し、それぞれ検体を採取した。
２．ヒストンアセチル化への効果
敗血症のGC抵抗性ではヒストン脱アセチル化酵素HDACは低下すると考えられており、そのため炎症関連遺伝子発現の転写は亢進する。一方、β２AR情報伝達系とGC代謝機構はともにHDACを調節することでヒストンアセチル化を制御し、炎症関連遺伝子発現の転写を抑制する。この仮説を証明する目的でヒストンアセチル化に関わるHAT, HDAC, Ac-Histoneの変化を測定した。以上の結果に基づき、β２AR活性化がGC細胞内代謝機構のひとつであるヒストンアセチル化現象に作用し、敗血症により示されるＧＣ抵抗性をどのように調節していくのかを、エピジェネテイクスの技術を用い解明している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．検体の抽出の遅れ。
動物実験および培養細胞実験からのサンプリングはほぼ終了したが、検体からヒストンを抽出する過程が予定を超える長時間となったため、予定としていた検体解析が進んでいない。
２．検体の測定解析の遅れ。
検体抽出の遅れから、腎臓のβ２ＡＲを活性化させた状態でGCを投与する本治療法の効果検討が、ヒストンアセチル化現象の解析実験までで終わっている。ヒストンアセチル化現象以外のＧＣ抵抗性の病態に対する本治療法の効果検討と解析作業には至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、腎臓のβ２ＡＲを活性化させた状態でGCを投与する本治療法の有効性を次の2点から評価する。
１．細胞内分子レベルでの評価：β２ＡＲ細胞内伝達系はGC細胞内代謝を調節することでGCの抗炎症作用を増強できるが、敗血症病態においても同様な効果を認めるかどうかは明らかでない。β２ＡＲ細胞内伝達系のどの構成因子がGC細胞内代謝機構のどの分子に作用し、敗血症により抵抗性を示すGC細胞内代謝をどのように調節するのか、またエピジェネテイクスにどのように関わるかを調べ、その結果として炎症に関連する遺伝子の発現をどのように制御するかを各阻害薬およびドミナントネガテイブ変異体を用いて解明する。
２．生体内反応レベルでの評価： 敗血症AKIモデル動物にβ２ＡＲ活性化とGC投与を組み合わせる治療法を適用し、その効果を、腎機能（血流動態、濾過能、電解質調節）、腎組織細胞形態（組織像、浸潤像、アポトーシス）、腎臓の炎症・免疫・内分泌・神経系（サイトカイン、アンジオテンシン、カテコラミン）の反応の時間経過から明らかにする。また、このGC抵抗性からの改善効果がβ２ＡＲに特異的な作用なのかどうかを検討する。さらに、本治療法が、敗血症病態の誘導因子（PAMPs、Alarmin）の阻害や、他臓器不全（脳、肺、心臓、肝臓）への進展防止に役立つかどうかを検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
昨年度は検体抽出、特にヒストン抽出作業に長時間必要としたため、ヒストンアセチル化現象以外のＧＣ代謝機構に対する本治療方法の効果検討や検体解析まで作業が進まなかった。従ってこれらの検討および解析用に使用する目的に充てていた昨年度予算額が次年度使用額として上乗せとなった。
昨年度の遅れを取り戻すため次の計画を予定している。
１、細胞内分子レベルでの評価：腎臓由来のマクロファージと尿細管上皮培養細胞を用い以下測定する。（１）リガンド（１１βＨＳＤ１＆2）。（２）グルココルチコイド受容体（ＧＲ）。（３）シャペロン。（４）MAPKの反応。（５）核タンパク転写因子。（６）炎症関連遺伝子発現：GC代謝機構が制御する炎症関連遺伝子の発現。 ２．生体内反応レベルでの評価：腹膜炎敗血症モデルラット（盲腸結紮1回穿刺法）を用いて以下測定し、データ解析し評価する。（１）腎機能の動態：新規腎機能マーカー、糸球体濾過率、腎血漿流量、浸透圧クレアランス、自由水クレアランス、尿中電解質から腎糸球体・尿細管機能。（２）組織・細胞の形態変化：組織変性およびアポトーシス細胞や関連蛋白群の反応。（３）免疫・炎症・内分泌・神経系の反応。（４）代表的な敗血症の誘導因子を測定する。
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