| 研究課題/領域番号 |
25462832
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
中村 明夫 帝京大学, 医学部, 講師 (70266287)
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| 研究分担者 |
宮川 誠 帝京大学, 中央動物実験施設, 教務職員 (80398734)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | β２アドレナリン受容体 / 敗血症 / 副腎皮質ステロイド薬 / エピジェネテイクス / 腎臓 / ＴＮＦ－α |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、腎臓のβ２アドレナリン（β２AR）を活性化させた状態でグルココルチコイド（GC）を投与する方法を敗血症ショックに伴う腎傷害の治療に適用し、その有効性を培養細胞を用いた細胞内分子レベルからの解析と、実験動物を用いた生体内反応レベルからの分析により明らかにすることである。
１．細胞内分子レベルの反応からの検討： ＬＰＳとデキサメサゾン（GC）を添加したラット腎臓由来のマクロファージ培養細胞を利用し、GC細胞内代謝諸因子に対するβ２AR活性化がもたらす効果を、リガンド（11βHSD１＆2）、グルココルチコイド受容体（GR）、シャペロン（Hsp90、FKBP5）、MAPK （MEK-1、ERK1/2、p38、JNK）、ヒストンアセチル化、転写因子、炎症関連サイトカイン遺伝子発現の各々GC代謝段階にわけて調べた。β２AR活性化はアデノウイルスをベクターとしたβ２AR遺伝子を導入することで作成した。その結果、β２AR活性化は、11βHSD１とGRα蛋白と遺伝子発現を増強し、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC活性の上昇も加わることでＮＦ－κＢを抑制し、その作用で炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α遺伝子発現の転写活性を減弱させた。これにより、β２AR活性化がGC細胞内代謝機構の各段階をどのように制御し、どのように炎症反応の抑制に寄与するかを確認できた。
２．生体内反応レベルから検討：β２AR活性化した腹膜炎敗血症モデルラット（ＣＬＰモデル）にデキサメサゾン（GC）を濃度別に投与し、β２AR活性化とGCを組み合わせた治療法が敗血症AKIの病態に与える効果を、腎機能測定と組織の状態から評価した。その結果、敗血症による腎機能低下（主に糸球体機能）と組織障害（糸球体肥大）は、β２ARの活性化とＧＣを投与したモデルラットにのみ改善が認められ、この治療法の敗血症への有用性を確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
腎臓のβ２アドレナリン（β２AR）を活性化させた状態でグルココルチコイド（GC）を投与する治療法の有効性を評価するために、本年度目標では、培養細胞を用いた細胞内分子レベルでの実験計画と、実験動物を使用した生体内反応レベルでの実験計画、特にエピジェネティック制御機構の解析を用意していた。
１．細胞内分子レベルでの実験からは、敗血症の腎傷害に関わる腎臓のマクロファージ細胞を用い、β２AR活性化がGC抵抗性の原因となるGC細胞内代謝機構の各段階をどのように制御し抗炎症効果の増強に寄与するかを評価することができた。
２．生体内反応レベルの実験からは、β２AR活性化した敗血症モデル動物（ＣＬＰラット）にＧＣを投与することで、敗血症AKIの腎形態および機能所見が改善するだけでなく、生存率も回復する事を観察できた。
３．エピジェネティック制御機構の解明：敗血症は、腎臓のヒストン蛋白(H2A, H2B, and H3)のアセチル化を減弱させる。ヒストン修飾酵素活性に関しては敗血症はHAT活性、HDAC1 HDAC3を抑制し、HDAC2, HDAC5活性を誘導する。この敗血症の状態にβ２ARを活性化させた場合は、β２ARがp300 を増加させることでHAT 活性を刺激しヒストン蛋白を増加させる。そしてHDAC2, 3, 5, 6を減少させる。一方H3K4me3、H3K27me3は敗血症状態にしても変化はない。しかしながらβ２AR活性化状態にした場合はH3K4me3は減弱し、H3K27me3は増強する。
これらの成果は本年度までに達成する目標であったため、“おおむね順調”に実験は進んでいると判断した
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの実験結果から、腎臓のβ２アドレナリン（β２AR）を活性化させグルココルチコイド（GC）を投与する治療方法が、敗血症に伴う腎傷害の細胞内と生体内の病態改善に有効であることを、細胞内レベルと生体内レベルから確認できた。今後も腎臓のβ２ARを活性化させた状態でGCを投与する治療法の効果機序を細胞内レベルから、その有効性を生体内レベルから生さらに明らかにしていく。今後の方策は以下の通りとなる。
１．細胞内分子レベルでの検討：敗血症病態下で腎障害に関連する血液細胞、マクロファージ、腎尿細管上皮細胞を用い、β２ARからの情報伝達系が、敗血症により減弱したGC細胞内代謝機構の諸分子を標的にどのように作用し、GCの炎症調節作用に関わる細胞内転写因子とヒストンアセチル化現象の反応をどのように制御できるかを明らかにする。そのために阻害薬およびドミナントネガテイブ変異体を用いて敗血症腎傷害の病態改善に関わる効果を詳細に明らかにする。
２．生体内レベルでの検討：研究課題である本治療法が、腎臓の炎症・免疫・内分泌・神経系にどのように作用するかを調べ、敗血症病態の誘導因子（PAMPs、Alarmin）の阻害や他臓器不全（脳、肺、心臓、肝臓）への進展防止に役立つかどうかを検討する。また、生体内からも本治療法がヒストンアセチル化をどのように制御するかを解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究を計画通り遂行するためには、当初予定の今年度と次年度の科研費年間予算額だけでは不足することが判明した。これは、研究課題である本治療法の機序解明と有効性の検証をエピジェネテイクスの面から更に進める必要性が出てきたためにある。従って、この不足分を補てんするため昨年度は民間財団の助成金を申請し、今年度は主にこの助成金を使用して実験を行った。次年度に不足する予算額は、今年度予算の一部を回すことで対応する必要性から次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の研究計画の中心課題は、敗血症におけるβ２AR活性化とGCを組み合わせた治療法の腎傷害防止効果をエピジェネティック制御機構、特にヒストン修飾を通じ解析することである。次年度は次の１～３の実験計画を予定している。実験方法として、培養細胞を用いた実験からその機序を明らかにし、敗血症モデルラットを用いたin vivo実験から生体内反応現象を観察する。
１．ヒストン修飾の定量的解析 （Ｈ３Ｋ９Ａｃ，Ｈ３Ｋ２７Ａｃ， Ｈ３Ｋ４ｍｅ３，Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３などの役割）。２．ヒストンアセチル化の酵素化学反応の解析。（ＨＡＴ， ＨＤＡＣ１～８などの酵素化学反応を観察）。３．標的遺伝子へのヒストン修飾の特異的解析（Ｃｈｉｐ法を利用してＴＮＦ－α遺伝子プロモーターへのヒストン修飾因子の関与を解明）
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