| 研究課題/領域番号 |
25462858
|
|---|
| 研究機関 | 広島大学 |
|---|
研究代表者 |
南崎 朋子 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 助教 (30452593)
|
|---|
| 研究分担者 |
吉子 裕二 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (20263709)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | Klotho / FGF23 / 骨代謝 |
|---|
| 研究概要 |
マウスsKL組換えタンパクsKL（マウスsKL）はヒトFGF23組換えタンパク（ヒトFGF23）と協働し、in vitroにおいて、ラットおよびマウス骨芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）、ヒト胎児腎（HEK）細胞等でERKのリン酸化を促進し、短時間でEgr-1 mRNA発現レベルを上昇した。一方、正常マウスに活性化型ビタミンＤを皮下投与して内因性FGF23の発現を促進した後、マウスsKLを静脈注射し、２時間後に各組織を回収したところ、骨においてのみ、ERKのリン酸化促進およびEgr-1 mRNAレベルの上昇が認められた。
ヒトKlotho組換えタンパク(ヒトsKL)についても、in vitroにおいて同様に検討したところ、ラットおよびマウス骨芽細胞、NHDFおよびHEK細胞のいずれにおいても、同様のシグナル伝達を認めた。培養骨芽細胞の増殖・分化においては影響が認められなかった。石灰化への影響については、検討中である。一方、Klotho KOマウスにヒトsKLおよびヒトFGF23を投与したところ、骨組織でのみERKリン酸化応答が確認された。
マウス乳癌（FM3A/R）細胞の培養上清および細胞ライセートを回収し、それぞれについてKlotho抗体を用いてWestern blottingを行ったところ、ともにsKLを検出した。メンブレンの有無により、FM3A/R乳癌細胞とラットまたはマウス骨芽細胞との共培養による細胞間相互作用について、石灰化への影響に着目して解析したところ、メンブレンを介した相互作用は認められず、細胞接着があった場合のみ、石灰化が促進した。
FM3A/R細胞が非転移性乳癌細胞であることから、その他の乳癌細胞株由来のKlothoの性状解析を、TOFMS等を用いて行う予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在解析に用いているFM3A/R細胞が非転移性の乳癌細胞であることから、高転移性のマウス乳癌細胞株4T1細胞、転移性乳癌細胞株MCF7-14細胞、その他の乳癌細胞株を入手し、それらの乳癌細胞由来のKlothoの性状解析を、TOFMS等を用いて行う予定である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
ヒトsKLおよび癌細胞由来Klothoについて、FGF23およびFGF受容体との複合体形成を確認する。
Klotho KOマウス由来骨芽細胞を培養し、タンパクまたはDNAアレイによって、sKLに添加よって変動するタンパクまたは遺伝子を検索する。また、これについて、リアルタイムRT-PCRによる発現プロファイルの再現性を確認し、明らかになった標的下流因子の癌細胞、骨（歯）、骨転移巣における局在を、in situ hybridization、リアルタイムRT-PCR、免疫染色、WB等により調べる。
上記下流因子のRNAiまたは発現ベクターを癌細胞もしくは骨系細胞に導入し、増殖、機能等の細胞応答を確認する。また、klotho KOマウスおよび正常マウスにヒトsKLを投与し、下流因子の発現変動を確認する。
klotho KOマウスまたは1,25D投与後の正常マウスに癌細胞由来Klothoを投与し、骨組織特異的に下流因子のmRNAおよびタンパク発現変動がみられることを確認する。
Klotho KOマウスの骨乳癌細胞等の左心室または静注(尾または頸静脈)等による乳癌骨転移モデルを作製し、その下流因子の評価を行う。
|
