| 研究課題/領域番号 |
25462875
|
|---|
| 研究機関 | 昭和大学 |
|---|
研究代表者 |
入江 太朗 昭和大学, 歯学部, 講師 (00317570)
|
|---|
| 研究分担者 |
美島 健二 昭和大学, 歯学部, 教授 (50275343)
森 泰昌 独立行政法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (00296708)
安原 理佳 昭和大学, 歯学部, 助教 (20453649)
山本 剛 昭和大学, 歯学部, 兼任講師 (80384189)
外薗 知恵 昭和大学, 歯学部, 助教 (10555296)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | コンディショナルトランスジェニックマウス / 唾液腺腫瘍 / 腫瘍組織発生 |
|---|
| 研究概要 |
本年度はPLAG1遺伝子をコンディショナルに発現させるためのlox-Pトランスジェニックマウスの作成のためのターゲッティングベクターの構築を目標としていた。しかし、本研究課題の申請書の実験計画に当初記載していたターゲッティングベクターの設計よりも、さらに本研究課題にとってメリットの高いターゲッティングベクターを既に構築し、それを用いたトランスジェニックマウスの作成を行い、それを論文報告していたグループ(ミシガン大学の三品裕司先生、東北大学の福田智一先生)が見いだされた。そこで、同グループにターゲッティングベクター(CAG-loxp-lacZ-pA-loxp-MCS-EGFP[CAG-Z-EGFP]プラスミド)の供与を依頼したところ、快く供与を承諾して頂きターゲッティングベクターを送付して頂いた。供与頂いたターゲッティングベクターのシークエンスによる配列の確認、DANAFORM社からのPLAG1 cDNAの購入を行った。この購入したPLAG1遺伝子を有するプラスミド保持菌を培養し、プラスミドからPLAG1 cDNAを切り出し、CAG-Z-EGFPプラスミドに挿入を試みた。しかし、PLAG1遺伝子が全長1.5kbとかなり大きいことから、なかなか正しい向きの挿入が実現しなかった。インサートを行ったコロニーを数多く解析することで、いくつかのインサートが適切に行われたと考えられるサンプルが得られたことから、現在このサンプルのシークエンスによるインサートの最終確認を行っている段階となっている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
「研究の目的」の達成度については、若干遅れがある状況である。これについては①当初予定していたターゲッティングベクターからミシガン大学の三品裕司先生、東北大学の福田智一先生らのグループが作成したターゲッティングベクターへと変更したこと、②このターゲッティングベクターに挿入するPLAG1 cDNAが全長1.5kbとかなり大きく、なかなか正しい向きの挿入が実現しなかったためである。しかし、同遺伝子のターゲッティングベクターへの導入とコロニーのピックアップの数を増やすことによりなんとかクリアできたと考えられる。この遺伝子導入の実験数が増えたことも若干の遅れを招いた原因である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
①アンピシリン耐性遺伝子、lacZ遺伝子を有するLITMUS28プラスミドに、CAGプロモーター、loxp、triple polyA、IRES-EGFPを挿入して作製したターゲッティングベクター（CAG-loxp-lacZ-pA-loxp-MCS-EGFP[CAG-Z-EGFP]）のMCSに、ヒトPLAG1遺伝子(理研DNAFORMより購入)を挿入したコンストラクトを直鎖化し、トランスジーンを受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションにより導入する。
②Tgマウスの作製
C57BL/6マウス8匹を前日に交配させ、プラグのついたマウスより受精卵を採取する。常法により、目的の○○発現系のDNA断片を受精卵前核にマイクロインジェクションを行なったのち、偽妊娠マウス（ICR)の卵管に移植する（DNA注入した受精卵20個／匹、3匹分程度になる）。受精卵採取に際しては、頸椎脱臼により安楽死後に行い、移植はペントバルビタール注射液（5㎎/ml)を腹腔内投与（50mg/kg)による麻酔下で行う。出生したマウスは、離乳時に尾部（数㎜）を採取して、遺伝子型を調べる。目的のマウスが数系統できた段階で作製を終了する。なお、Tgマウスの作製は、動物実験施設に依頼して行う。
③The Jackson Laboratory から購入したkeratin 14 遺伝子のプロモータ下流にCreERTM を有するCreERTM マウスとloxPマウスを掛け合わせCreERTM-loxP マウスを作成する。表現型を確認。
④タモキシフェン投与0 日から腫瘍組織の完成までのサンプルを回収する。HE 染色、免疫染色を行い病理組織学的な解析を行う。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度はトランスジェニックマウス作成のためのマウスの購入・飼育費用がかからなかったため
次年度にトランスジェニックマウス作成のためのマウスの購入・飼育費用が必要となることからこれに使用する。
|
