| 研究課題/領域番号 |
25462876
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
梶原 景正 東海大学, 医学部, 講師 (00204397)
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| 研究分担者 |
木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
渡部 聡 独立行政法人農業生物資源研究所, 畜産ゲノム研究ユニット, 主任研究員 (80391572)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 顎形態形成 / Sez12 / Tbx1 / BMP / TGF-beta / 22q11.2欠失症候群 |
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| 研究概要 |
Sez12ノックアウトマウス（Sez12-KOマウス）胎仔線維芽細胞（Sez12-KO MEF）を調製し、野生型細胞（WT MEF）を対照として、BMP2またはTGF-ßが活性させる一連のシグナル分子（Smad分子群）のリン酸化アッセイを検討した。さらにルシフェラーゼ活性を指標に、BMPシグナル標的であるTlxプロモーターやTGFβシグナル標的である3TPプロモーターを用いたシグナルアッセイも行ない、両アッセイともSez12がBMP・TGFシグナルを抑制するという結果が得られた。
Sez12の細胞内局在を検討した。ヒトHEK293細胞にマウスSez12遺伝子発現ベクターを導入し、抗Sez12抗体で組織化学的に解析したところ、Sez12は細胞膜に局在していた。従って、Sez12は細胞膜でTGFβ・BMPシグナルの受容体と相互作用して各々のシグナル伝達を調節している可能性が示唆された。
Sez12ノックアウトマウスの顎顔面形成不全の原因について検討した。Sez12-KOマウスは、Sez12遺伝子プロモーターによりGFPを発現する。GFP発現領域を組織化学的に検討したところ、頭蓋底の軟骨結合、特に静止軟骨・肥大軟骨でGFP発現が顕著であった。従って、Sez12が欠失することで頭蓋底軟骨の異常による頭蓋底形成不全が引き起こされ、Sez12-KOマウスの顎顔面形態異常が起こる可能性が考えられた。
Tbx1を含むゲノム欠失をもつDf1/+マウスより軟骨細胞や血管平滑筋細胞を調製し、近年注目されているジンクフィンガーヌクレアーゼによる高頻度標的遺伝子破壊技術を用いて、クリスパー法によりDf1/+細胞にSez12欠失を引き起こさせる計画を実行した。今年度はSez12ゲノム特異的な塩基配列を検討し、クリスパー／Casベクターを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
抗Sez12抗体を用いた細胞組織化学的解析により顎顔面形成不全の原因細胞を肥大軟骨細胞と静止軟骨細胞に特定でき、また解析領域も頭蓋底軟骨結合に絞ることができた。ただし、細胞膜上におけるSez12とBMP/TGF-ß受容体との相互作用について、細胞が内在性に発現するSez12とBMP/TGF-ß受容体を組織化学的に同定することが困難であったため、発現ベクターを調製しなければならず、各々の発現レベル調整などで解析の進行が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. Sez12とBMP/TGF-ß受容体との相互作用を細胞レベルで同定し、Tbx1がどのように関わっているのかを組織化学的に検討する。
2. マウス初代軟骨細胞を調製し、分化段階でのSez12・BMP/TGF-ß受容体・Tbx1の発現動態を検討する。
3. 新たな遺伝子工学的技術であるクリスパー／Casシステムを用いて、マウス初代細胞でのSez12／Tbx1ダブルノックアウトを構築する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
細胞膜上におけるSez12とBMP/TGF-ß受容体との相互作用について様々な細胞を用いて検討したが、内在性に発現するSez12とBMP/TGF-ß受容体を組織化学的に同定することが困難であった。そのため各々の遺伝子発現ベクターを構築する必要があり、糖鎖構造変化によるSez12-BMP/TGF-ß相互作用の解析を次年度以降に行なわなければならず、繰越金が発生した。
Sez12とBMP/TGF-ß受容体との相互作用を細胞レベルで同定し、Tbx1がどのように関わっているのかを組織化学的に検討する。マウス初代軟骨細胞を調製し、分化段階でのSez12・BMP/TGF-ß受容体・Tbx1の発現動態を検討する。新たな遺伝子工学的技術であるクリスパー／Casシステムを用いて、マウス初代細胞でのSez12／Tbx1ダブルノックアウトを構築する。以上の今後の研究計画に加えて繰越金で以下の実験計画を行なう予定である。
Sez12発現ベクターおよびBMP受容体／TGF-ß受容体発現ベクターを各種細胞に導入し、各種抗体用いて各々の局在を明らかにし、Sez12-BMP/TGF-ß相互作用を検討する。今年度行なえなかったSuf-1やSuf-2ノックダウン細胞を作製し、Sez12存在下でBMPシグナル／TGF-ßシグナルがどのように変化するかを検討する。
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