| 研究課題/領域番号 |
25462877
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
古西 清司 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (20178289)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 侵襲性歯周炎 / キノン / ペルオキシダーゼ |
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| 研究実績の概要 |
限局性侵襲性歯周炎の原因菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansが産生するキノールペルオキシダーゼ(QPO)は、本菌の過酸化水素耐性や毒素（ロイコトキシン）産生と密接に関わっている。QPOは呼吸鎖成分で生理的な電子メディエータのキノンの還元型を基質として利用できることから、呼吸鎖と連結している、あるいは呼吸鎖の一成分とも考えられる。今までの酵素学的な動力学的解析結果より、QPOの触媒反応はping pong Bi Bi機構で説明できると考えられ、複数の学会でその結果については報告してきたが、論文として発表するにはさらに追加の解析が必要である。また、すでにascofuranoneが極めて強力なmixed-typeの阻害剤であることを論文として発表済みであるが、その後ascholorin、ilicicolin B、ilicicolin F、N-heptyl-quinoline N-oxide(HQNO)、緑膿菌のクオラムセンシングに関係している2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone(PQS)もQPOに対する強力な阻害剤であることを見出し、その阻害様式についても解析を行った。この結果も学会発表済みであるが、論文としてまとめるためには追加実験が必要である。さらにリコンビナントQPOの大腸菌での大量発現系は報告済みであるが、現在部位特異的な突然変異体の作製中である。すなわち今までに、N末端領域1/3（推定キノール結合ドメイン）に存在しているヘムcの第六配位座の可能性があるMet残基とHis残基（いずれもよく保存されている）の部位特異的な変異体を作製して、発現と活性を調べたが、いずれも発現量が極めて少なく、活性の検討には至らなかった。他の保存されているアミノ酸残基に関しても随時、変異体を作製している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今までに、QPOの阻害剤としてascofuranoneを発見し、論文に発表してきた。最近新たな阻害剤として、ascochlorin、ilicicolin B、ilicicolin F、HQNO、PQSを見出し、その阻害様式に関して複数の学会に発表してきたが、論文にまとめるために追加の解析を現在行っている。また、QPOの分子レベルでの反応様式を解析してきたが、こちらも論文として発表するための追加の研究を行っている。またリコンビナントQPOの部位特異的変異体はクイックチェンジ法を用いて複数作製中である。さらに、QPOの分子レベルでの触媒反応様式はping pong Bi Bi機構であることを証明してきたが、この結果に関しては現在、論文を準備中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
リコンビナントQPO発現系を用いて変異体の作製を引き続き行う。随時、得られた変異体は大量発現方法、精製方法、吸収スペクトル、酵素活性、epr、円二色性、標準酸化還元電位について解析し、個々のアミノ酸残基の役割について検討する。また、QPOの阻害剤の探索も引き続き行う。
カイコを用いたA. actinomycetemcomitansの感染実験についてはすでに論文として報告済みである。この実験系に関与している病原因子として、ロイコトキシン(LtxA)が推定されている。そこで、LtxA欠損変異株の作製を行い、カイコに投与した時に野生株との間で有意差があるか検討をする予定である。また、LtｘAの精製を行い、カイコに投与することも検討中である。さらにすでにQPOの欠損変異したA. actinomycetemcomitansはLtxAの発言量の減少を報告している。またQPOの阻害剤のascofranoneを本菌に投与した場合もLtxAの発現量が極端に減少することも論文に報告済みである。そこで今回、QPO変異株とその野生株をカイコに投与して有意差があるかを検討する。さらに野生株投与後QPO阻害剤をカイコに投与して影響を調べ、QPOやLtxAが病原因子であるかを検討する。
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