新規ジペプチジルペプチダーゼ酵素群の発現と細胞内分布の解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25462894
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 根本 優子 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10164667)
• 研究分担者: 根本 孝幸 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90164665) ; 木村 重信 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (10177917)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ジペプチジルペプチダーゼ / 歯周病原性細菌 / 酵素

研究概要

我々が発見した新規ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)11を中心として，歯周病原性細菌であるPorphyromonas gingivalisの病原性に関与するジペプチド分解系の解明を目指し，DPP11およびその他DPP酵素群の発現と細胞内分布について検討した。P. gingivalis ATCC 33277株の培養は既報に基づき1ug/ml menadion添加培地，嫌気条件で培養し，ゲノムDNAを精製した。各DPP遺伝子を含む発現ベクターを作成し，Escherichia coli XL1-Blue株に導入後，IPTG誘導によりリコンビナント体を発現精製した。酵素活性は各種ジペプチド-MCA蛍光基質で測定した。また，耐性遺伝子を含むDNA断片をPCR等によって作成し，得られたDNA断片を相同組換えによって親株に導入し，種々のDPP遺伝子破壊株を作成した。野生株，単一DPP欠損株，及び多重DPP欠損株の増殖能について検討した結果，多重DPP欠損株での顕著な増殖遅延が観察された。DPPの細胞内局在は，菌体外画分，外膜，ペリプラズム，内膜，及び細胞質をそれぞれ細胞分画法とショ糖密度勾配遠心で調製し，画分画についてDPP酵素活性と免疫ブロット法検討したところ，DPPは主にペリプラズム画分に局在することを見出し報告した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

既知の3種類のDPPの欠損株や複数種類のDPP欠損株の作成に成功した。これらの菌株を用いた検討から，これまではAspergillus fumigatus等の病原性及び非病原性真菌でのみ報告のあったDPP5が原核生物であるP. gingivalisで発現し，機能していることを発見した。P. gingivalis DPP5の発見により，DPP5遺伝子は真性細菌，古細菌，および高等動植物まで広く分布していることが明らかとなった。DPP5はN末端から2番目のAla及び疎水性アミノ酸と3番目のアミノ酸の間のペプチド結合を特異的に加水分解すること，また，P. gingivalisでは他のDPPと同様に主にペリプラズムに局在し，2量体で存在することを見出し報告した。

今後の研究の推進方策

これまでの検討から，P. gingivalisでは4種類のDPPが主にペリプラズムに局在するものと考えられた。一方，インクレチン代謝に関与するDPP4は，ヒト細胞では細胞膜結合型と遊離型の両者があり，いずれも2量体で存在することが知られている。DPPの局在と2量体化の分子メカニズムについて，P. gingivalis ATCC 33277から作成した種々の遺伝子破壊株，及び，種々のP. gingivalis菌株を用いて検討する。各々のDPP遺伝子の発現については，当初計画に従い定量的PCRにより検討する。また, DPP酵素群の病原性についての検討を開始する予定である。

次年度の研究費の使用計画

測定精度をあげる目的でHPLCの設置を済ませたが，追加の必要関連機器，消耗品の購入にあてるために次年度に繰り越した。
HPLC用カラム，及び関連消耗品，修理費等にあてる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Identification and characterization of prokaryotic dipeptidyl-peptidase 5 from Porphyromonas gingivalis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohara-Nemoto, Y., Rouf, S.M.A., Naito, M., Yanase, A., Tetsuo, F., Ono, T., Kobayakawa, T., Shimoyama, Y., Kimura, S., Nakayama, K., Saiki, K., Konishi, K., and Nemoto, T.K.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 289 ページ: 5436-5448
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.527333
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] In vitro processing of glutamyl endopeptidase proenzymes from Enterococcus faecalis and importance of N-terminal residue in enzyme catalysis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Rouf, S.M.A., Ohara-Nemoto, Y., Ono, T., Shimoyama, Y., Kimura, S., Nemoto, T.K.
  • 雑誌名: Advances in Biochemistry 巻: 1 ページ: 73-80
  • DOI: 10.11648/j.ab.20130105.11
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phenylalanine 664 of dipeptidyl peptidase (DPP) 7 and phenylalanine 671 of DPP11 mediate preference for P2-position hydrophobic residues of a substrate. (2013)
  • 著者名/発表者名: Rouf, S.M.A., Ohara-Nemoto, Y., Ono, T., Shimoyama, Y., Kimura, S., Nemoto, T.K.
  • 雑誌名: FEBS Open Bio. 巻: 3 ページ: 177-183
  • DOI: 10.1016/j.fob.2013.03.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Measurement of protease activity of exfoliative toxin A using synthetic peptidyl substrates and correlation between in vivo and in vitro activities. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tachi, M. T., Ohara-Nemoto, Y., Baba, T.T., Kobayakawa, T., Fujita, S., Ikeda, T., Ayuse, T., Oi, K., Nemoto, T.K.
  • 雑誌名: Acta Med. Nagasaki. 巻: 58 ページ: 41-48
  • 査読あり
• [雑誌論文] Involvement of geranylgeranylation of Rho and Rac GTPases in adipogenic and RANKL expression, which was inhibited by simvastatin. (2013)
  • 著者名/発表者名: Baba, T.T., Ohara-Nemoto, Y., Miyazaki, T., Nemoto, T.K.
  • 雑誌名: Cell Biochem. Funct. 巻: 31 ページ: 652-659
  • DOI: 10.1002/cbf.2951
  • 査読あり
• [学会発表] Porphyromonas endodontalisの発現するユニークなジペプチジルペプチダーゼ(DPP)VおよびDPP7. (2013)
  • 著者名/発表者名: 柳瀬絵美，根本優子，下山佑，木村重信，馬場友巳，根本孝幸
  • 学会等名: 第55回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 岡山コンベンションセンター（岡山県岡山市）
  • 年月日: 20130921-20130922
• [学会発表] Identification and Characterization of Dipeptidyl-Peptidase V as a Member for Dipeptide Production in Porphyromonas gingivalis. (2013)
  • 著者名/発表者名: 根本孝幸，ラオフ シャーク ムハマド アブデュー，根本優子，下山佑，木村重信
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] Towards the structural basis of peptide binding to dipeptidyl peptidase 11 of Porphyromonas gingivalis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Bezerra, G. A., Ohara-Nemoto, Y., Nemoto, T.K., Djinovic-Carugo, K.
  • 学会等名: Recent Advances in Macromolecular Crystallization
  • 発表場所: Le Bischenberg Conference Centre (Strasbourg, France）
  • 年月日: 20130908-20130911
• [学会発表] Dipeptide production in Porphyromonas gingivalis mediated by dipeptidyl peptidases and gingipains. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohara-Nemoto, Y., Abdur-Rouf, S. M., Shimoyama, Y., Kimura, S., and Nemoto, T. K.
  • 学会等名: 113rd General meeting of ASM
  • 発表場所: The Colorado Convention Center (Denver, USA)
  • 年月日: 20130518-20130521
• [学会発表] Distribution of Porphyromonas gingivalis fimA genotypes in the children’s plaques. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shioyama, Y., Ohara-Nemoto, Y., Kimura, M., Sasaki, M., Tanaka, M., and Kimura, S.
  • 学会等名: 113rd General meeting of ASM
  • 発表場所: The Colorado Convention Center (Denver, USA)
  • 年月日: 20130518-20130521
• [備考] 原核生物で初めてジペプチジルペプチダーゼ５(DPP5)を発見
  • URL: http://www.nagasaki-u.ac.jp/ja/about/info/science/science71.html
• [備考] 長崎大 歯周病細菌で原核生物では初のDPP5を発見
  • URL: http://www.qlifepro.com/news/20140319/gum-disease-bacteria-found-in-prokaryotic-dpp5s-first.html
• [備考] 長崎大 歯周病細菌で原核生物では初のDPP5を発見 - QLifePro医療ニュース
  • URL: http://buzz.news.yahoo.co.jp/article/7d8b598590aeb94d1a3e66b61b87fa6186aa632c/