| 研究課題/領域番号 |
25462897
|
|---|
| 研究機関 | 岩手医科大学 |
|---|
研究代表者 |
毛塚 雄一郎 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (50397163)
|
|---|
| 研究分担者 |
吉田 康夫 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (10315096)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 硫化水素産生 / 酵素 / 歯周病 / 口臭 |
|---|
| 研究概要 |
口腔細菌により産生される硫化水素は口臭の主要な原因物質であり、歯周病を進行させる一因としても知られる。歯周病原細菌であるFusobacterium nucleatumは高い硫化水素産生能を持つ。本研究では、これらのうち特に硫化水素産生への寄与が高いと考えられているFn1220とFn1055を対象とし、阻害剤の探索を最終目標としている。
Fn1055の触媒反応において塩基として働くと考えられるアミノ酸残基を部位特異的に置換した変異酵素を用いて、基質であるL-システインとの共結晶を作成した。構造解析の結果、L-システインは補因子であるピリドキサール5'-リン酸と共有結合した中間体として観測された。また、触媒部位を含むクレフトは閉じた形をしていた。得られた結晶構造は、Fn1055による触媒反応が、クレフトの開閉を伴うL-システインのβ脱離反応により進むことを改めて支持する結果であった。さらに、触媒反応あるいは基質結合に関与すると考えられるアミノ酸を置換した変異酵素を調製した。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた酵素活性測定を利用することにより、各種変異酵素の酵素学的パラメータを決定した。
当初の計画では、in silicoスクリーニングにより阻害剤の探索を進める予定であった。しかし、公的化合物ライブラリーや文部科学省の支援事業の充実を考慮して、実際の化合物スクリーニングにより阻害剤の探索を行った方が確実にヒット化合物を得られる可能性が高いと考え、計画を変更した。Fn1220に関しては、スクリーニングに向けた予備実験を進め、アッセイ系の構築に取り掛かっている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
概ね順調に進んでいる。酵素学的解析については、両酵素について各種変異酵素を含め概ね終了したと考えている。反応速度論解析に対しても準備を進めており、実施できる見込みである。構造解析においてもFn1055で基質複合体の構造を得ることができた。化合物スクリーニングに関しては計画変更もあり、若干の遅れはあるものの、別の酵素で進めている系を一部改変して利用することで速やかに対応できるものと考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
化合物スクリーニングのアッセイ系構築およびバリデーションを中心に進める。アッセイ系の構築については前述の通り既存の系の改変により対応することができる。実際の化合物スクリーニングは東北大学（星陵キャンパス）の設備を利用することを考えている。すでに設備の利用経験があることから円滑に対応することが可能である。化合物サンプルは、公的化合物ライブラリーの提供を受ける計画である。ヒット化合物が得られた場合、酵素反応の阻害効果を評価すると同時に、酵素との複合体の結晶構造解析に向け、結晶化を進める。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
スクリーニングの計画変更により、必要となる消耗品や試薬が変更となった。
大規模な化合物スクリーニングを行うためには、マイクロプレートなどの消耗品に加え、化合物サンプルの提供にかかる実費および東北大学までの旅費が必要となるので、平成25年度に使用しなかった研究費はこれらに充てる。26年度配分される研究費は、消耗品、一般実験器具、学会および論文での成果発表、実験補助に対する謝金に使用する。
|
