| 研究課題/領域番号 |
25462901
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
吉垣 純子 日本大学, 歯学部, 教授 (40256904)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 唾液腺 / 分泌顆粒 / 選別輸送 / 調節性分泌 / 構成性分泌 |
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| 研究概要 |
唾液腺における分泌タンパク質の輸送先の選別機構を解明するために，小胞で輸送されるタンパク質とHaloTagタンパク質との融合遺伝子を作成した。HaloTagは，人工的な蛍光リガンドを結合するように設計されたリポータータンパク質であり，膜透過性リガンドを培地に添加することによって，生きた状態で局在の変化を観察することが出来る。これまでの研究で， HaloTagに唾液タンパク質の1つであるアミラーゼのシグナルペプチド配列を付加した遺伝子(ssHalo)をアデノウイルスに組み込み，耳下腺腺房細胞の初代培養細胞に発現させると，融合タンパク質が分泌顆粒へ輸送されることを報告している。しかし，アミラーゼの全長遺伝子は大きく，アデノウイルスに組み込むことができなかったため，シグナル配列のみの効果とアミラーゼ全長タンパク質の効果を比較することが出来なかった。そこで，選別を受けるタンパク質の候補として，唾液中に分泌されるタンパク質であるParotid secretory protein (PSP)やシスタチンDに注目した。これらはアミラーゼよりも分子量が小さく，全長をウイルスベクターに組み込むことが容易であると考えた。また，カテプシンBはタンパク質合成後，一度分泌顆粒に運ばれるが，顆粒の成熟に伴って排除され，リソゾームへ輸送されることが知られている。したがって，唾液タンパク質とは異なる影響がみられると考えた。そこで，PSP，シスタチンD，プロカテプシンBの遺伝子をクローニングし，HaloTagとの融合遺伝子を作成し，アデノウイルスによる発現系を構築した。これらを耳下腺腺房細胞に発現させると，いずれも分泌顆粒マーカーであるアミラーゼの局在と重なった。しかし，共局在の効率は用いた標的タンパク質によって差がみられることから，そのアミノ酸配列中に何らかのシグナルが含まれていることが予想された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の第一の目標は，新たな標的タンパク質とHaloTagとの融合タンパク質の発現系を作成し，細胞内局在の解析や刺激依存的・非依存的な分泌量をssHaloと比較することによって，標的タンパク質の種類が選別輸送に影響を与えるのかどうかを調べることであった。平成25年度の研究において，選別を受けるタンパク質の候補として，唾液タンパク質としてPSPおよびシスタチンD，未成熟分泌顆粒から排除されるタンパク質としてプロカテプシンBの遺伝子をクローニングし，HaloTagとの融合タンパク質の発現系を構築し，アデノウイルスベクターを作成した。耳下腺腺房細胞の初代培養細胞にそれぞれの融合タンパク質を発現させて局在を調べると，分泌顆粒マーカーであるアミラーゼのシグナルと重なったことから，分泌顆粒へ輸送されていると考えられた。しかし，融合タンパク質の作成に用いた標的タンパク質の種類によって，アミラーゼとのシグナルの共局在の程度が異なることが見いだされた。また，分泌顆粒へ輸送された指標として，βアドレナリン受容体刺激による分泌増加を測定したところ，いずれのタンパク質も刺激依存的に分泌が増強されたが，非刺激時と刺激時の分泌量に標的タンパク質によって違いがみられた。このことから，今回用いた標的タンパク質のアミノ酸配列中に，選別輸送に関わるシグナルが含まれている可能性が示された。したがって，第一の目標は達成しつつある。さらに，エリスロポエチンなど構成性分泌経路へ輸送される候補となるタンパク質の遺伝子もクローニングし，発現系を構築した。今年度は構成性分泌へ輸送するためのシグナルの存在の有無について解析し，さらに2つの輸送経路を明確に区別するために細胞内滞在時間や合成分解速度の測定を行っていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 平成25年度の結果により，当初の予想通り，今回用いた標的タンパク質のアミノ酸配列中に選別輸送に関わるシグナルがある可能性が示された。シグナルの候補として，分泌タンパク質の表面電荷が選別輸送に影響を与えると予測される。そこで，高次構造が報告されているタンパク質については，表面に露出している電荷アミノ酸をシグナル候補とし，高次構造が報告されていないタンパク質については，表面に露出する可能性の高い電荷アミノ酸を2次構造予測を利用して選択する。シグナル候補と考えられる塩基性アミノ酸や酸性アミノ酸に変異を導入する。また，シグナル候補として，糖鎖も考えられるので，グリコシレーション部位予測Webサイトで予想されるグリコシル化部位に部位特異的アミノ酸変異を導入する。これらの変異による輸送効率への影響を調べ，選別輸送シグナルの同定を試みる。
(2) HaloTagタンパク質の利点として，2種類以上のリガンドを時間を変えて添加することによって，パルスラベルが可能なことが上げられる。この性質を用い，細胞内局在の時間変化や細胞内滞在時間の測定など，時間分解能の高い測定が可能になる。そこで，タンパク質が合成されてから，分泌されるまでの局在変化を観察する。調節性分泌経路に輸送されれば，ゴルジ装置から分泌顆粒へ移動し，顆粒内に貯留していく様子が観察されるはずである。一方，構成性分泌であれば，ゴルジ装置から細胞外へすぐに輸送されると予想される。また，調節性に分泌されるタンパク質は，刺激を受けるまで細胞内に滞在するのに対して，構成性分泌の場合は，合成後直ちに分泌されることが予測される。一定時間に合成されたタンパク質のみを蛍光ラベルし，細胞外に分泌される蛍光HaloTag量の時間変化を測定する。これらの解析を(1)の変異の解析と組み合わせることにより，選別輸送の効率を定量的に評価する。
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