| 研究課題/領域番号 |
25462907
|
|---|
| 研究機関 | 福岡歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
岡本 富士雄 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (60153938)
|
|---|
| 研究分担者 |
鍛治屋 浩 福岡歯科大学, 歯学部, 講師 (80177378)
岡部 幸司 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (80224046)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 破骨細胞 / 骨吸収 / アクチンリング / カルシウム活性化カリウムチャネル / 非選択的陽イオンチャネル |
|---|
| 研究概要 |
本年度は、成熟破骨細胞におけるCa2+活性化K+チャネルと非選択性陽イオンチャネルの発現を機能的に捉えるとともに骨吸収への関与を検討した。
マウス骨髄細胞をM-CSFとRANKLで刺激して酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)陽性多核の成熟破骨細胞を誘導した。この成熟破骨細胞にWhole-cell patch clamp法を適用して膜電流を記録すると、外向き整流性K+電流と非選択性陽イオン電流を検出した。外向き整流性K+電流は細胞内Ca2+濃度上昇により強く活性化され、電流活性化に伴って膜は過分極した。外向き整流性K+電流はCa2+活性化K+チャネル（KCa チャネル）阻害剤および電位依存性K+チャネル（Kvチャネル）阻害剤により抑制された。また、非選択的性陽イオン電流はruthenium red感受性を持つTRPV様電流とMg2+感受性を持つTRPM7様電流であることが解った。
成熟破骨細胞の骨吸収活性に対するこれらの阻害剤の効果を検討するため、リン酸カルシウムコートした培養プレート上で成熟破骨細胞を培養し、形成された吸収窩の面積を計測した。その結果、KCaとKv両チャネルの阻害剤は骨吸収を強く抑制したが、KCaチャネル阻害作用のないKvチャネル選択的阻害剤の抑制作用は弱かった。また、ruthenium redも骨吸収を抑制した。一方、アクチンリングを有するTRAP陽性多核細胞の数は、これらのK+チャネル阻害剤およびruthenium redにより減少する傾向を示したが、阻害剤を加えないcontrol群と比べて有意差は認められなかった。
以上の結果より、成熟破骨細胞には、KCaチャネル、Kvチャネルおよび非選択性陽イオンチャネルが発現しイオン輸送体として機能していることが明らかになった。また、これらのチャネルは骨吸収を支持する重要な役割を担っていることが示唆された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
成熟破骨細胞にWhole-cell patch clamp法を適用し、Ca2+活性化K+チャネル（KCa チャネル）、電位依存性K+チャネル（Kvチャネル）および非選択性陽イオンチャネルが活性化されていることを機能的に証明した。また、KCaチャネルの活性化が膜を過分極させ、非選択的陽イオンチャネルからのCa2+流入を促進する可能性が強まった。これらの事象の関連性は細胞内Ca2+ストアからのCa2+放出がさらなる細胞内Ca2+濃度（[Ca2+]i）上昇を引き起こす（正帰還[Ca2+]i制御）機構の存在を強く示唆する。本年度に計画していたイオンチャネルの分子種の同定については、用いた抗体の選択性が低く、確信を持てる結果が得られなかったため、次年度の計画に盛り込んだ。そのため、この計画に変えて、27年度に予定していたKCaチャネルの骨吸収活性に及ぼす効果を先に検討した。その結果、KCaチャネル阻害剤が骨吸収活性を強く抑制することが明らかになり、KCaチャネルの骨吸収への機能的関与を証明できた。以上の成果は本研究計画の約30％を達成するものであり、本研究課題はおおむね順調に進行していると考える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度、成熟破骨細胞にはCa2+活性化K+チャネル(KCa チャネル)が存在することをWhole-cell patch clamp法を用いて機能的に証明した。本年度は、成熟破骨細胞に発現するKCa チャネルの分子種を免疫染色法およびWestern blot法を用いて検討する。また、TRPチャネルの発現についても同様に検討し、特に、TRPV4とTRPM7の発現について検討する。
これらの結果をふまえて、同定したチャネルの選択的阻害剤による機能抑制およびshRNAによる発現抑制を試み、細胞内Ca2+濃度に及ぼす効果と骨吸収活性に及ぼす効果を調べる。
結果より、KCaチャネルの活性化、過分極誘発、Ca2+流入、これらの３事象の関連性を検証し、細胞内Ca2+ストアからのCa2+放出がさらなる[Ca2+]i上昇を引き起こす（正帰還[Ca2+]i制御）機構の存在をさらに明確にするとともに、正帰還[Ca2+]i制御機構を構成するKCaチャネルとTRPチャネルの分子種を明らかにする。
また、正帰還[Ca2+]i制御機構を動員する骨吸収調節因子の検索を行なう。種々の骨吸収調節因子の中で、正帰還[Ca2+]i 制御機構を動員する因子を、KCa チャネルとTRPチャネル活性および[Ca2+]iの変化を指標に検索する。破骨細胞に直接作用する因子（ホルモンやサイトカインおよび薬剤）を対象に、特に、カルシトニン、RANKL、ビスフォスフォネートの作用を検討する。
|
