| 研究課題/領域番号 |
25462920
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
福間 裕 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (50253688)
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| 研究分担者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
岡元 邦彰 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10311846)
西下 一久 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20237697)
坂井 詠子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10176612)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 細胞内プロテアーゼ / 上皮性癌 |
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| 研究実績の概要 |
これまで癌におけるプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）の機能は、増殖・浸潤・転移に関与する「悪玉因子」として作用すると考えられてきた。しかしながら、我々はエンドソーム・リソソーム性プロテアーゼであるカテプシンEが抗腫瘍効果を示す「善玉因子」として機能することを見出した。本プロテアーゼは、in vitro の実験系で、癌細胞のみを濃度依存的にアポトーシスに誘導し、免疫系細胞の活性化などを通じて、腫瘍の増殖・転移を抑制しているようである。最近我々は、in vivoでも、カテプシンE欠損マウスが上皮性癌を発症することを見出している。本研究では、抗腫瘍効果を示すプロテアーゼのさらなる分子メカニズム、特に上皮細胞における発癌に関する分子機構の解明と予防・診断・治療への応用を目指す研究を遂行する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は以下のような３つの項目の実験を行った。
１）カテプシンE欠損マウスにおける酸化ストレスの上昇機構の解明： カテプシンE欠損マウスの血清を検査すると、H2O2の値が異常に高いことに気が付いた。そこで、生体に多量に含まれる還元タンパク質であるグルタチオンに関して存在レベルを測定すると、これらの結果から、カテプシンEの欠損マウスでは酸化ストレスが上昇していることが明らかになった。
２）酸化タンパク質の蓄積の免疫組織学的解析による同定： 細胞や組織で発生する活性酸素種（ROS）は近くに存在するタンパク質を非特異的に酸化することが知られている。タンパク質がROSにより酸化修飾を受け、カルボニル誘導体となったタンパク質を特異的に検出することができる2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）を用いて、カルボニル 基を誘導体化し、DNPH特異的抗体で免疫組織化学的解析を行う。このことにより、カテプシンE欠損マウスでの酸化タンパク質の蓄積を組織レベルで解析を行った。
３）組織、細胞での酸化タンパク質のプロテオーム解析： カテプシンEはプロテアーゼであることから、特殊な酸化タンパク質分解に関与している可能性も充分考えられた。そこで野生型マウスとカテプシンE欠損マウスの癌の特徴を生化学的に解析する目的で、癌病変部のプロテオーム解析を行った。カテプシンE欠損マウスの癌病変部位および野生型マウスの正常同一部位を切除し、切除組織からタンパク質を抽出後、２次元電気泳動で展開し、変化の大きいタンパク質スポットを同定している途中である。今後は定法通り、質量分析法にてタンパク質のアミノ酸残基からタンパク質を同定する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は以下のような研究を行う予定である。
１）カテプシンE酵素による癌治療への試み
カテプシンEが癌細胞の増殖を抑制するかを調べるために、ヒトの前立腺癌であるALVA101に空ベクターとヒト・カテプシンEを含むベクターを発現させた細胞群の同数をヌードマウスへ移植２９日後肉眼的観察した。結果は、明らかに増殖が小さくなっていた。病理組織学的解析により、カテプシンE発現細胞はよく発達した被膜構造物によって仕切られていた。ここでは以下に述べる治療効果の検討を行う。
２）カテプシンE酵素製剤の直接注射による癌細胞増殖抑制効果の検討
ヒト由来前立腺がん細胞（ALVA-41,ALVA-10）をヌードマウス右脇腹皮下に移植し、腫瘍がある一定の大きさに達したのちに、生理食塩水と精製カテプシンE酵素を１０～２０日投与し、腫瘍の大きさを測定した。予備実験ながら、カテプシンE投与により、癌は退縮した。雄ヌードマウス５匹に対して、生理食塩水あるいは精製カテプシンEを200μg/kg/dayを１６日続けると、腫瘍の大きさが半分にまで退縮するという結果を得ている。今後、組み換え型ヒト・カテプシンEを大量精製し、投与方法などを検討してさらに効率の良い抗癌作用をもたらす方法を開発する。
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