| 研究課題/領域番号 |
25463106
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大廣 洋一 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 講師 (40301915)
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| 研究分担者 |
秋山 廣輔 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 特任助教 (10609100)
進藤 正信 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (20162802)
鄭 漢忠 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (80180066)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 腫瘍血管内皮細胞 / がん幹細胞 / 薬剤抵抗性 |
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| 研究概要 |
１）口腔がん臨床サンプルにおけるがん幹細胞の局在解析：口腔がんにおけるがん幹細胞の局在をCD133,CD44, ALDH,PSF-1をもちいた組織免疫染色で明らかにし，腫瘍血管との位置関係を解析した．
２）がん幹細胞の分離：ヒト舌癌をはじめとして異なる転移能をもつ悪性腫瘍細胞株を用いてCD133, CD44,SP分画ならびにALDH活性などによりがん幹細胞と成熟がん細胞を分離した．
３）腫瘍血管内皮細胞の分離：上記口腔がん腫瘍株のマウス移植モデルから腫瘍血管内皮細胞をCD31抗体とCD45 抗体とを用いてFACS aria 2 によりCD31+CD45-の分画として分離した．
４）がん幹細胞のcharacterization： PCR法とフローサイトメーターを用いて，分離したがん幹細胞の幹細胞マーカーの発現を確認した．さらにALDEFLUOR(商品名)キットを用いてALDHの活性を計測し，Hoechst
33342を用いてFACS Aria 2によりSide populationを解析する．さらにanoikis 抵抗性をspheroid assay により確認した．
５）細胞内活性酸素の測定：分離・培養したがん幹細胞ならびにがん細胞における細胞内活性酸素をFACS Aria-2により測定し比較・解析したところ，がん幹細胞により高い活性酸素の蓄積が見られた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今回の研究では，口腔がん幹細胞と口腔がん血管内皮細胞との相互作用を解析し，口腔がん幹細胞の維持に腫瘍血管内皮が果たす役割を検討し，口腔がん幹細胞のVascular Nicheを標的とした新しいがん治療法の開発の基盤的研究を行うことを目的に下記を検討している。
①口腔癌におけるがん幹細胞 (CSC)と腫瘍血管内皮細胞 (TEC)の局在を解析する．②口腔癌におけるCSCの薬剤抵抗性，未分化性の維持ならびに抗apoptosis能（anoikisに対する抵抗性）に口腔がん由来TECがどのように関与しているかを解明する。③TEC由来のangiocrine factorの制御ならびにVascular Nicheを制御することで，がん幹細胞を効果的に攻撃できる方法を探る．
以上の予定していた計画の大半を実施しており，翌年度の研究を円滑に進めることができる状況であるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）分離後のがん幹細胞（CSC）と腫瘍血管内皮（TEC）との相互作用解析(薬剤抵抗性)： CSCとTECとの共培養，およびCSCへのTEC培養上清(TEC-CM)の処理を行い，シスプラチンなどの抗がん剤に対する抵抗性の変化をコントロール群と比較検討する．
２）分離後のCSCとTECとの相互作用解析(足場非依存性)：CSCとTECとの共培養，およびCSCへのTEC培養上清(TEC-CM)の処理を行い，低血清条件下でspheroid assayをおこないanoikis抵抗性の変化をコントロール群と比較検討する．
３）分離後のCSCとTECとの相互作用解析(未分化性維持)：CSCとTECとの共培養共培養，およびCSCへのTEC培養上清(TEC-CM)の処理を行い，CSCがnon-CSCへ分化せず，未分化細胞として維持されるかをコントロール群と比較検討する．解析にはPCR法とフローサイトメーターを用いて，がん幹細胞の幹細胞マーカーの発現を確認する．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
in vitroにおける実験は概ね予想通りの試薬・消耗品を消費したが、口腔がんの臨床材料が予想を下回る検体数であったため、幹細胞同定・分離に用いる予定であった抗体の使用が少量ですんだため。
次年度は、臨床材料を獲得する状況を外来生検にも拡大するため検体数が増大することが見込まれる。よって、当該年度で使用予定であった抗体を次年度に加えて使用する予定である。
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