一過性脳虚血が誘導する神経再生機転と幹細胞の検討

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25463159
• 研究機関: 大阪歯科大学
• 研究代表者: 百田 義弘 大阪歯科大学, 歯学部, 講師(非常勤) (60247880)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 神経幹細胞 / 局所脳虚血 / 神経再生

研究概要

我々は、これまで一過性局所脳虚血再灌流後に大脳皮質虚血負荷領域においても免疫組織化学染色法および電子顕微鏡を用いた形態学的に神経幹細胞が産生される可能性を明らにした。今回、虚血負荷領域の組織を採取し、細胞培養を行うことで虚血負荷により誘導される神経幹細胞の特性を観察した。
6－10週令のCB-17/icr- SCID /SCIDマウス（雄）の左側中大脳動脈に7.0ナイロンモノフィラメントを使用して、吸入麻酔下で脳傷害を起こさない15分間、および脳傷害が発生する20分間の一過性虚血誘導操作を行った。虚血再灌流操作3日後に虚血負荷領域の組織を採取し、18ゲージ、23ゲージと27ゲージの針を通過させて解離し、接着培地で培養し細胞数を数えた。この細胞をニューロスフィア様細胞塊の形成を促進する浮遊培地中で培養し、得られたニューロスフィア様細胞塊を神経分化培地で分化し、免疫組織化学染色を行った。対照として、正常側の組織を採取し培養した。
その結果、虚血巣より得られた細胞は永久閉塞による梗塞巣からは500-700万個、20分虚血後の虚血巣からは、200-300万個、15分虚血後の脳からは80-250万個であり、一過性虚血後には内因性幹細胞産生数は少ないことが示唆された。しかし、一過性虚血負荷組織からもニューロスフィア様細胞塊が形成され、これらはTuj-1陽性であった。
以上より、軽度の虚血負荷後であっても神経幹細胞産生は起こるが、虚血負荷が軽いとその産生量は少なく、また、神経細胞への分化も少ないことが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

虚血負荷領域から採取し、接着培地で培養した細胞数を比較し虚血負荷の程度により内在性神経幹細胞数が異なることが示唆され、これまでのin vivoでの実験結果と同様の結果がin vitroでも証明された。
さらに、これらの細胞を浮遊培地において培養することにも成功し、細胞数は少ないもののニューロスフェア様細胞塊の形成にも成功し、今後の神経分化能の特性を解析する観点においても実験経過は順調に進展しているものと考えている。

今後の研究の推進方策

虚血負荷により誘導される神経幹細胞を培養し、形成されたニューロスフェア様細胞塊について免疫組織化学染色、形態学的特性についてさらに探求するとともに、得られた神経幹細胞の起源が血管周皮細胞である可能性についても検討する予定である。

次年度の研究費の使用計画

虚血負荷を加えることにより得られた細胞の起源を明確にする上で、免疫組織染色が必要であり，抗体試薬が必要である。さらに，細胞培養に必要な培地、試薬が必要である。
免疫染色電子顕微鏡観察を行う上でも試薬を含む消耗品が必要である。
神経幹細胞のマーカーであるnestin抗体，血管周皮細胞のマーカーであるPDGF-β，幼弱神経細胞マーカーであるTuj-1等と用いて電子顕微鏡による形態学的観察を継続する計画である。

研究成果

• [雑誌論文] The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad (2014)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto N, Momota Y, Hashimoto Y, Tatsumi S, Ando K, Omasa T, Kotani J
  • 雑誌名: Clinical Oral Investigations 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1007/s00784-013-1166-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of autophagy restores the loss of sevoflurane preconditioning (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiomi M, Miyamae M, Takemura G, Kaneda K, Inamura Y, Onishi A, Koshinuma S, Momota Y, Minami T
  • 雑誌名: European Journal of Pharmacology 巻: 724(5) ページ: 58-66
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2013.12.027
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sevoflurane induceds cardioprotection through reactive oxgen species-mediated upregulation of autophagy in isolated gunea pig hearts (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiomi M, Miyamae M, Takemura G, Kaneda K, Onishi A, Koshinuma S, Momota Y, Minami T
  • 雑誌名: Journal of Anesthesia 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1007/s00540-013-1755-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] A highly reproducible model of cerebral ischemia/repefusion with extended survival in CB-17 mice (2013)
  • 著者名/発表者名: Kasahara Y, Ihara M, Nakagomi T, Momota Y, Stern DM, Matsuyama T, Taguchi A
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: 76 ページ: 163-168
  • DOI: 10.1016/j.neures.2013.04.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sevoflurane increases p38 mitogen activated protein kinase phosphorylation during ischemia, but its cardioprotective effect is not blocked by SB203580 (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyamae M, Kaneda K, Inamura Y, Shiomi M, Koshinuma S, Momota Y, Figueredo VM
  • 雑誌名: Journal of Oral Tissue Engineering 巻: 11(1) ページ: 17-28
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lidocaine protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in anesthetized rabbits (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamabayashi K, Momota Y, Miyamae M, Kaneda K, Kotani J
  • 雑誌名: Journal of Osaka Dental University 巻: 47(2) ページ: 201-207
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dedifferentiated fat cells differentiate into osteoblasts in titanium fiber mesh (2013)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto N, Momota Y, Hashimoto Y, Ando K, Omasa T, Kotani J
  • 雑誌名: Cytotechnology 巻: 65(1) ページ: 15-22
  • DOI: 1o.1007/s10616-012-9456-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sevoflurane confers additive cardioprotection to ethanol preconditioning associated with enhanced phosphorylation of glycogen synthase kinase-3βand inhibition of mitochondrial permeability transition pore opening (2013)
  • 著者名/発表者名: Onishi A, Miyamae M, Inoue H, Kaneda K, Okusa C, Inamura Y, Shiomi M, Koshinuma S, Momota Y, Figueredo VM
  • 雑誌名: Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia 巻: 27(5) ページ: 916-924
  • DOI: 10.1053/j.jvca.2012.10.002
  • 査読あり
• [学会発表] Mild ischemic insult promotes neurogenesis in the cerebral cortex
  • 著者名/発表者名: 中田雅代，百田義弘，中込隆之，中野亜紀子，河原麻衣子，Shan Lu，小谷順一郎，松山知弘
  • 学会等名: Neuro 2013
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都市）
• [学会発表] Generation of endogenous neural stem cells in the ipsilateral thalamus following cortical infarction
  • 著者名/発表者名: 柴田啓貴，百田義弘，中込隆之，中野亜紀子，河原麻衣子，中田雅代，盧 山，小谷順一郎，松山知弘
  • 学会等名: Neuro 2013
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都市）
• [学会発表] 軽度の虚血負荷は大脳皮質における神経再生を促進する
  • 著者名/発表者名: 中田雅代，百田義弘，柴田啓貴，大草知佳，小谷順一郎
  • 学会等名: 第41回日本歯科麻酔学会
  • 発表場所: 新横浜国際ホテル（横浜市）
• [学会発表] 大脳皮質梗塞にともなう二次性神経変性領域での内因性神経幹細胞の発現
  • 著者名/発表者名: 柴田啓貴，百田義弘，中田雅代，小谷順一郎
  • 学会等名: 第41回日本歯科麻酔学会
  • 発表場所: 新横浜国際ホテル（横浜市）
• [学会発表] Mild ischemic insult promotes neurogenesis in the cerebral cortex
  • 著者名/発表者名: 中田雅代，百田義弘，中込隆之，土居亜紀子，河原麻衣子，佐久間理香，柴田啓貴，盧 山，立花久大，小谷順一郎，松山知弘
  • 学会等名: 第25回日本脳循環代謝学会
  • 発表場所: 京王プラザホテル札幌（札幌市）
• [図書] 歯科衛生士テキスト 歯科麻酔学 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小谷順一郎,佐久間泰司,足立了平（編）安東佳代子,今村佳樹,大草知佳,大西杏奈,加藤裕彦,金田一弘,釜田隆,河合峰雄,岸本直隆,木下郁恵,河見有恵,椎葉俊司,杉岡伸悟,大郷英里奈,田中沙里奈,豊永達宣,松下容子,真鍋庸三,百田義弘,山下智章,山本直子（著）
  • 総ページ数: 127 (22-25)
  • 出版者: 学建書院