| 研究課題/領域番号 |
25463182
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
長谷川 智一 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 講師 (50274668)
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| 研究分担者 |
吉村 善隆 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (30230816)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 歯根膜細胞 / 間葉系幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
［目的］齲蝕や外傷、矯正治療における歯周組織および歯髄組織の再生および恒常性の維持には、それぞれの組織の修復制御機構について理解することが重要である。そして再生に関与する間葉系幹細胞などの遊走制御機構の解析が不可欠である。SDF-1 α はケモカインファミリーの一つでCXCL12とも呼ばれている。その受容体であるCXCR4を介して、血管内皮前駆細胞や間葉系幹細胞の遊走に関与していることが報告されている。そこで我々が樹立したヒト不死化乳歯歯根膜細胞株（歯根膜細胞）SH9細胞を使用してSDF-1の発現およびその調節機構について解析を行った。
［材料と方法］1. SH9におけるSDF-1およびCXCR4 mRNAの発現の確認：RT-PCR法によりSDF-1およびCXCR4 mRNAの発現を確認した。さらに間葉系幹細胞株UE13T-7細胞，ヒト骨肉種細胞株MG-63およびSaos-2細胞でも検討を行った。 2. SH9におけるSDF-1およびCXCR4産生の確認：Western blottingおよび免疫染色法により蛋白レベルでの発現の確認を行った。 3. SH9により産生されたSDF-1が、UE13T-7細胞の遊走を誘導するか検討を行った。
［結果および考察］1. SH9においてSDF-1およびCXCR4 mRNAが発現していることが明らかとなった。UE13T-7， MG-63およびSaos-2でも発現が認められた。またCXCR4の発現も全ての細胞株で認められた。 2. Western blotting法による解析より、SH9およびUE13T-7において、cell lysateおよびconditioned medium中にSDF-1の発現が認められた。さらに免疫染色法により、SH9およびUE13T-7においてSDF-1およびCXCR4の発現が認められた。 3. SH9のconditioned mediumはUE7T-13の細胞遊走を誘導した。しかしCXCR4の阻害剤であるAMD3100でUE7T-13を処理することで、conditioned mediumによる遊走誘導を阻害した。以上のことからSH9の産生するSDF-1により間葉系幹細胞の遊走が誘導されることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト乳歯歯根膜細胞株SH9細胞におけるSDF-1αの産生を、mRNAレベルおよび蛋白質レベルで示すことが可能となった。さらにtransmembrane migration assayによりSH9のconditioned mediumが間葉系幹細胞株UE13T-7細胞の遊走を誘導することを示した。SDF-1αの受容体であるCXCR4の阻害剤であるAMD3100でUE13T-7の遊走誘導が阻害されたことから、この細胞遊走誘導はSH9によって産生されたSDF-1αによると考えられた。
さらに昨年度から継続して、fibroblast growth factor 2 (FGF-2)によるSH9細胞のSDF-1α発現抑制機構の解析を行っている。昨年度はJNK, p38, MEKさらにPI3 kinase経路の阻害剤を投与しても、FGF-2によるSDF-1の発現抑制効果を解除できなかったことを報告した。今年度はさらに阻害剤PP1によるSrc経路、U-73122によるPLCγ経路、STO-609 によるCaMKⅡ経路、Staurosporin によるPKC経路、RKI-1447によるROCK経路の解析を行った。その結果、FGF-2の作用を解除可能な細胞内シグナル経路について細胞形態の調節機構が関与している可能性を考えている。
以上の2つの結果から、FGF-2などのサイトカインによるSDF-1発現の調節機構が明らかとなれば、歯周組織だけでなく歯髄組織における恒常性の維持機構について、間葉系幹細胞の遊走調節機構と融合した考察が可能と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
SDF-1αは骨髄中で血球系幹細胞の維持に必須なことが最もよく知られている。しかしその他の生理作用として、間葉系幹細胞や血管内皮前駆細胞の遊走を誘導することが知られている。創傷治癒には血管新生が重要であり、また組織の再生には組織幹細胞の供給が必要であると考えられる。すなわち局所の修復・再生において歯根膜が産生するSDF-1の機能は非常に重要であると考えられる。
そこで今後もヒト乳歯歯根膜細胞SH9細胞を利用してSDF-1αの発現調節機構の解析を行う予定である。さらにFGF-2などのサイトカインによるSDF-1発現の調節機構が明らかとなれば、歯周組織だけでなく歯髄組織における恒常性の維持機構について、間葉系幹細胞の遊走調節機構と融合した考察が可能と考えている。
現在までにFGF受容体から下流のいくつかの細胞内シグナル経路が絞られており、今後はその経路が正しいのかどうか解析を行う予定である。具体的にはDNA chip/ microarrayにより候補遺伝子のうちどれが関与しているのかを同定する予定である。その後候補遺伝子のsiRNAや阻害剤によるloss of function、および発現ベクターによるgain of functionの手法で検討を行っていく予定である。さらに細胞形態が遺伝子発現を調節している可能性も見出した。こちらはまた新たな解析系を構築して解析する予定である。
また昨年度は新しい圧迫培養系の構築を行った。今まで細胞を伸展して培養するシステムは存在したが、安定した圧迫培養の機械は無かった。この新しい圧迫培養の系を使用することで外傷や矯正治療を想定した解析を行う予定である。
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