2013 年度実施状況報告書

軟骨細胞における機械的刺激応答の細胞極性による制御

研究課題

研究課題/領域番号	25463186
研究機関	九州大学
研究代表者	安永敦九州大学, 大学病院, その他 (80515990)
研究分担者	高橋一郎九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (70241643) 星健治九州大学, 大学病院, 助教 (90569964)
研究期間 (年度)	2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード	軟骨細胞 / メカニカルストレス
研究概要	本研究は、三次元コラーゲンゲル培養法とタイムラプス顕微鏡を組み合わせ、軟骨細胞の分化メカニズムと細胞極性や細胞内情報伝達分子との関わりに注目し、機械的刺激応答の分子メカニズムの解明をめざす。 ERK2-GFP fusionタンパク発現ベクターをATDC5細胞へトランスフェクションし、発現を確認した。また、ERK2-GFPを発現したATDC5をガラスボトムディッシュに播種し、ガラスニードルとマイクロマニピュレータを用いて伸展刺激を加えることにより、ERK2の核移行が認められることを再確認した。 Cellmatrix Type I-Aを用い、ガラスボトムディッシュにコラーゲンゲル層 (Base Layer)を作製した。その上に、細胞を混合したコラーゲンゲルをBase Layer上に注ぎ、Cell Layerとした。さらに、変位を評価するための指標となる蛍光標識したマイクロスフェア（Fluosphere、直径1.0 …m、2.7x1010 個/ml）を懸濁した1%アガロース/PBSでコーティングし、Top Layerとした。DMEM/F-12, 5%FBS下で培養を行い、観察直前にnuclear-ID Red DNA stainを添加したフェノールレッド不含のLibovit's L-15培地へ交換後、共焦点レーザー顕微鏡による解析を行うことにより、最適な細胞密度と蛍光マイクロスフェアの濃度を決定した。これにより、3次元コラーゲンゲル培養の条件設定が完了した。また、II型コラーゲンプロモーター・エンハンサー領域を含み、赤色蛍光蛋白 (DsRed)をレポーターとして発現するプラスミドを作製、ATDC5にトランスフェクションを行った。 Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)を添加し、軟骨分化誘導を行ったところ、蛍光顕微鏡下でDsRedの蛍光強度が増加した。これにより、軟骨前駆細胞が軟骨細胞へ分化するステップをリアルタイムで把握することが可能となった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 ERKの活性化と軟骨分化活性の両方をリアルタイムで観察する準備が整っており、また3次元コラーゲンゲルに伸展力を負荷するための基礎的な条件設定が終了しているため。
今後の研究の推進方策	3次元コラーゲンゲル培養したERK-GFPおよびcol2a1 promoter-DsRedを発現する細胞に、マイクロマニピュレーターを用いることにより機械的刺激を負荷、蛍光顕微鏡下でERKやCol2a1の活性をリアルタイムで観察する。さらに、生細胞を標識する蛍光試薬を用いて軟骨細胞分化に伴う細胞極性の獲得過程を可視化する。脂質膜（細胞膜および脂質小胞）および核を、それぞれPHK26もしくはPHK67およびCYTO13もしくはCYTO17により標識誌、細胞分化と細胞形態の変化を観察する。
次年度の研究費の使用計画	消耗品の購入を次年度に繰り越したため消耗品の購入をする予定である