| 研究課題/領域番号 |
25463192
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
稲田 絵美 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568)
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| 研究分担者 |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ先端医療開発研究センター・遺伝子発現制御学分野, 教授 (30287099)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
野口 洋文 独立行政法人国立病院機構(千葉東病院臨床研究センター), 外科・移植再生学, 研究員 (50378733)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 歯髄幹細胞 / PiggyBacシステム / 選択的濃縮 / アルカリ性フォスファターゼ |
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| 研究概要 |
乳歯は６～１２歳頃の歯の生え代わりの際に、廃棄されるのが通常であったが、最近その歯髄から幹細胞を得て、それを歯の再生医療に利用する動きが高まりつつある。それに伴い、歯髄幹細胞（DPSCs, dental pulp stem cells）の特性について、いくつかの知見が集積されたが、その特性についての解析はまだ不十分な感がある。本研究課題では、DPSCsにおいてOCT4等の未分化細胞特異的な遺伝子、中でもES/iPS細胞や始原生殖細胞などのごく幼弱な細胞に活性が高いとされるアルカリ性フォスファターゼ（ALP）を発現するものが真のDPSCsと考え、遺伝子工学的手法を用い、ALP陽性細胞を初代歯髄細胞から選択的に濃縮し、その特性を解析することにより、歯の再生に向けたDPSCsの可能性を見出すことを主眼とする。平成２５年度はヒト乳歯歯髄細胞からの遺伝子導入安定株の効率的取得法に関する検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一般的に初代培養細胞への遺伝子導入は効率が低く、遺伝子導入株を得ることは難しいとされる。そこで、遺伝子導入効率が高いとされるpiggyBac（PB）トランスポゾンによる遺伝子導入法を初代歯髄細胞に適用することを考えた。細胞に蛍光遺伝子を内蔵するトランスポゾンとPB transposase発現ベクターと共にInvitrogen社のNeon systemを用い、遺伝子導入を行った。その結果、効率的に遺伝子導入安定株が取得でき、且つ長期培養後も導入遺伝子が脱落せず、その発現が持続されることが示された。本研究課題では遺伝子工学的にALP陽性細胞を特異的に濃縮することを目的とする。そのため、ALP promoter の制御下EGFPとneoを同時発現するプラスミドpAEINを構築する必要がある。現在、一回の遺伝子導入で、一つの細胞内にEGFPと赤蛍光遺伝子を同時発現させることに成功している。
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| 今後の研究の推進方策 |
PBトランスポゾンによるヒト乳歯歯髄細胞への効率的遺伝子導入については、平成２６年度日本小児歯科学会学術大会での発表、年内の論文投稿を予定している。平成２６年度はpAEIN をトランスポゾンシステムに組替えたプラスミドpT-AEINを構築し、乳歯歯髄細胞への遺伝子導入を試みる。遺伝子導入後、薬剤選別を行い、生じたコロニーを用い、ALP発現の有無、幹細胞としての特性の有無について分子生物学的解析を進める予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２６年度以降、分子生物学的解析や組織標本作製を行う機会が増える見込みであり、そのための消耗品およびその他の費用として翌年度分の助成金として請求した。
平成２６年度の研究費使用計画は以下の通りである。
物品費：細胞培養用試薬、分子生物学用酵素、大腸菌培養用試薬等の消耗品、旅費：日本小児歯科学会、歯科基礎医学会学術大会の参加と研究打ち合わせ、謝金：研究補助の謝金、その他：論文校正料、投稿料を計上した。
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