| 研究課題/領域番号 |
25463192
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (30448568)
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| 研究分担者 |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 歯髄幹細胞 / PiggyBacシステム / 選択的濃縮 / アルカリフォスファターゼ |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、歯髄幹細胞（DPSCs, dental pulp stem cells）においてOCT4等の未分化細胞特異的な遺伝子、中でもES/iPS細胞や始原生殖細胞などのごく幼弱な細胞に活性が高いとされるアルカリ性フォスファターゼ（ALP）を発現するものが多分化能を有する、いわゆる「authentic DPSCs」と考え、遺伝子工学的手法を用い、ALP陽性細胞を初代歯髄細胞から選択的に濃縮し、その特性を解析することにより、歯の再生に適用可能なDPSCsとしての有効性を見出すことを目的とした。
最初に、ALP promoter （ALPp）の制御下、EGFPを発現するプラスミドpALPEを構築し、歯髄細胞への遺伝子導入を試みた結果、EGFPを発現する歯髄細胞を見出した。次に、高遺伝子導入効率を示すpiggyBacトランスポゾン系を用いてALP陽性細胞を単離すべく、ALPpの制御下EGFPとpuromycin耐性遺伝子を同時発現するトランスポゾン型プラスミドpTA-ALPEIPを構築し、これをtransposase発現ベクターと共に歯髄細胞に遺伝子導入し、薬剤で選別後、遺伝子導入安定株を得る試みを行ったが、選別後に細胞が劣化する傾向が頻繁に見られ、解析可能な細胞数を確保することが困難だった。そこで、別の試みとして、HDDPCを単一細胞に解離後、ALP活性検索のための組織化学染色を行い、陽性細胞を実体顕微鏡下mouthpieceで制御されたマイクロキャピラリーで採取する試みを行った。その結果、単一細胞を採取することに成功したので、今後、単一細胞からcDNAを増幅した後、各種解析を行う予定である。また一方で、細胞劣化への対策として、歯髄細胞に不死化遺伝子の導入を試み、親株の特性を保持した不死化細胞株を樹立したので、これを用いてALP陽性細胞単離へ向けた再実験を行っている。
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