| 研究課題/領域番号 |
25463230
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (80246917)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 細菌 / 核酸 / 遺伝子 / non-coding RNA / 病原性 / 歯周病 |
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| 研究概要 |
本研究は，重篤な歯周病と最も関連性のあるred complex３菌種に、侵襲性歯周炎の原因細菌の１つであるAggregatibacter actinomycetemcomitansを加えた４菌種のnon-coding small RNAsを最新の次世代シークエンサーを用いて網羅的に同定・解析し、in silicoで予測されているnon-coding RNAを検証するとともに、新規のnon-coding RNAを発見するし，病原因子関連遺伝子の新たな転写調節メカニズムの解明と，歯周病診断に有用な診断マーカーとなり得るプローブを見出すことを目的とする。
平成25年度は，Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola およびA. actinomycetemcomitansの４菌種について，次世代シークエンサーにかける試料作成を行った。各菌種をそれぞれ適当な培地にて培養し，hemin 制限，酸化ストレス，温度ストレス，pH ストレスをかけ，経時的にサンプルを抽出した。Trizol/column法（Invitrogen）にてtotal RNA を精製し，Nanodrop（分光光度計）を用いた濃度測定とAgilent 2100 Bioanalyzer を用いた濃度・RNA の品質管理をおこない精製した試料のRNA の分解が進んでいないことを確かめた。ここから 23Sと16SrRNAを除去し, さらに5S rRNA および tRNA が含まれる100bp以下のサイズを除去することで，mRNAとnon-coding RNA rich サンプルを作成した。作成したサンプルは，Agilent 2100 Bioanalyzer を用いてrRNA やtRNA の除去が充分であることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度は次世代シークエンサーにかける細菌の試料作成であり、計画に従い重篤な歯周病と最も関連性のあるred complex３菌種（Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola ）に、侵襲性歯周炎の原因細菌の１つであるAggregatibacter actinomycetemcomitansを加えた４菌種について，各種ストレスを加えた後RNAを抽出，mRNA-richな試料に精製することで，次世代シークエンサーにかける試料作成を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
イルミナ社 TruSeq RNA Sample Prep Kit を用いて，RNA 断片化，逆転写反応，2nd 鎖 cDNA 合成，および末端修復（3’A 付加）を行い，サンプル識別用インデックスタグを含むアダプターライゲーションを行う。PCR 増幅を施した後，AMPureXP ビーズによる精製・低分子除去（約150bp）を行い, 次世代シークエンス用ライブラリーを調整し，次世代シークエンサーによる塩基配列の解読および解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
旅費として計上していた分が早期割引で安価になったため。また、別の学会では大学で使用できる公費を使ったため。
次年度において計上される費用の大部分が次世代シークエンサーの使用にかかるため、学会出張費の一部として使用する計画である。
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