| 研究課題/領域番号 |
25503001
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
三浦 史仁 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50447348)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | アカパンカビ / DNAメチル化 / エピゲノム / プロテオーム / ヒストン翻訳後化学修飾 |
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| 研究概要 |
アカパンカビにおいてDNAメチル化とかかわりのあるエピゲノム情報の収集を試みた。研究計画では、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）、染色体免疫沈降シークエンシング（ChIP-Seq）、マイクロコッカルヌクレアーゼシークエンシング（MNase-Seq）およびRNAシークエンシング（RNA-Seq）によるデータ取得を行う予定であったが、今年度は、前者2つの方法によるデータ取得を実施した。
WGBSによるメチロームデータの取得はMethylC-Seqにより行った。アカパンカビにおける主なDNAメチル化の対象領域として知られているRIP領域はAとTの塩基に富んだ配列を有しており、なぜかMethylC-Seqではこの領域に重点的にリードが張り付くという現象が確認された。この結果、ゲノム全体を重厚なリードで網羅するメチロームデータを得るためにはより多くの配列決定を行う必要があったものの、それ以外の点では生物学的再現性を検証するための複数のデータ取得も合わせて順調に作業が進んでいる。ChIP-Seq法によるヒストンの化学修飾状態の決定は、ヒストンH3の4および9番目のリシンのトリメチル化、4、9、18、27、36、56、79番目のリシンのアセチル化に加えて、ヒストンH4の5、8、12、16番目のリシンのアセチル化に対する抗体を用いたデータの取得が完了しており、これらの修飾のDNAメチル化との関係性について解析を進めている。DNAメチル化との深い関わりが知られているHP1に関しては特異的抗体が入手できないため、抗体作成のための抗原タンパク質の準備を行う必要があったが、これは平成25年度中に行うことはできなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
MethylC-Seq、ChIP-Seqのデータ取得に関しては、大きな障害もなく順調に進んでいる。MNase-SeqやRNA-Seqのデータ取得が済んでいないものの、これまでの過程で実際に実験を担当した大学院生がアカパンカビの扱いに熟練したため、計画的に実験が進められる見込みが立っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、アカパンカビのHP1の組み換えタンパク質を調製して抗HP1抗体の作出を行う。タンパク調製は自ら実施し、抗体作成は適切なカスタムサービスを選定し依頼する。RIP領域の構成タンパク質の同定を試みるプロテオーム解析に関しては、当初Nucleoprotein Hybridization法によるRIP領域の精製を行う方針であったが、ヒストンH3の9番目のリシンのトリメチル化（H3K9me3）に対する抗体の質が高く、染色体免疫沈降の効率も非常に高かったこと、およびこの抗体を用いたChIP-Seq解析によってそのRIP領域への局在の特異性が高いことが確認されたことから、免疫沈降による精製濃縮へと方針を切り替えて実験を進める予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度は実験実施の都合上から、主な物品費の用途となるアカパンカビHP1の組み換えタンパク質の調製やRIP領域の精製・濃縮を行わなかったため、次年度使用額が生じた。
平成25年度実施予定だったアカパンカビHP1の組み換えタンパク質調製とRIP領域の精製・濃縮は平成26年度中に行う。
HP1のタンパク質調製のために必要なキット類を購入し、組み換えたんぱく質の発現・精製を行う。次いで、得られたタンパク質を用いた抗体作成を外部に依頼する。
また、抗H3K9me3抗体を入手し、RIP領域の精製・濃縮を行う。この際に必要となるクロマトグラフィー装置およびその消耗品類を導入する。RIP領域の精製・濃縮が出来た場合は、外部研究機関へ質量分析によるペプチド解析を依頼する。
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