| 研究課題/領域番号 |
25504001
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
目崎 喜弘 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40431621)
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| 研究分担者 |
妹尾 春樹 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90171355)
山口 典子 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90251553)
吉川 究 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90400481)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ビタミンA / ヤツメウナギ |
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| 研究概要 |
ラットのビタミンA代謝関連酵素遺伝子のうちレシチン：レチノールアシルトランスフェラーゼ（LRAT）cDNAをクローニングし発現系を構築した。LRATはホスファチジルコリンのsn-1位のアシル基を転移してビタミンA（レチノール）とエステル結合させる酵素である。ラット肝臓mRNAから逆転写して得られたcDNAを鋳型としてPCR法でクローニングした。また肝臓星細胞より調製したcDNAライブラリを作成したので他のビタミンA代謝関連酵素遺伝子クローニングに活用する。得られたLRATのcDNAを胎児腎由来細胞株293Tに導入しビタミンAを添加したところ細胞内にレチニルエステルが形成されることを高速液体クロマトグラフィーで確認した。さらに大量のLRATタンパク質を得る目的で昆虫細胞にバキュロウイルスを感染させてLRATタンパク質を作成した。ヒスチジンタグを融合したLRATタンパク質が作られていることを抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認した。ヤツメウナギのビタミンA代謝関連酵素遺伝子は現在ドラフト配列が公開されているウミヤツメ（アメリカ合衆国・カナダ国境の五大湖に住むヤツメウナギ）のゲノム情報を活用してクローニングを試みている。ヤツメウナギにはLRAT活性をもつと予測されるタンパク質が2種類存在することが知られているが、そのうちの1種についてcDNA部分配列のクローニングに成功した。この部分配列を用いてノザンブロッティングにより発現臓器の特定を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ビタミンA代謝関連酵素遺伝子のいくつかについてクローニングに成功し、発現タンパク質の活性測定にも成功しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
他のビタミンA代謝関連酵素遺伝子のクローニングを進める。またLRAT酵素活性に及ぼす細胞内レチノール結合タンパク質（CRBP)の効果についても測定を開始する。活性測定系は293T細胞への遺伝子導入とビタミンA添加、HPLCによるビタミンA定量を組み合わせて開始する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ラットのビタミンA代謝関連酵素遺伝子の単離が順調に進んだため、分子生物学的解析試薬の使用量を予定より少なく済ますことができた。
ヤツメウナギのLRAT遺伝子のcDNAが部分配列しか得られなかったので、次年度使用額を用いてcDNAライブラリ法、RACE法など複数の遺伝子クローニング法を試みる。
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