| 研究課題/領域番号 |
25504015
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
細野 崇 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (80445741)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 神経細胞 / アミロイドβ / PC12細胞 / 硫化水素 |
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| 研究実績の概要 |
アルツハイマー病の原因はまだ分かっていない。しかし、臨床的には脳内でアミロイドβタンパク質（アミロイドβ）が凝集してアミロイド斑として沈着し、やがて神経細胞が死滅することから、アミロイドβがアルツハイマー病の原因物質と考えるアミロイド・カスケード仮説が有力となっている。昨年度まで培養神経細胞にアミロイドβを処理し、神経細胞傷害活性を測定してきたものの、神経細胞障害活性値が実験ごとに大きく異なり、結果が安定しない問題があった。そこで本年度は、細胞傷害活性測定方法の変更、アミロイドβ調製方法の変更、実験に使用するアミロイドβの変更を行った。
まず、細胞傷害活性の測定方法はミトコンドリア活性を指標にしたMTT法を使用していたが、細胞膜が傷付くことで細胞内の乳酸脱水素酵素が培養培地へ逸脱することを指標にしたLDH法に変更した。また、アミロイドβは単量体として調製したあと、細胞に添加することで重合させて細胞障害を誘導していたが、論文を参考にあらかじめアミロイドβオリゴマーを形成させた後に添加する方法に変更した。さらに、実験に使用するアミロイドβの種類を変更した。以上の変更により、アミロイドβによる細胞障害活性を安定的に測定できることに成功した。また、LDH法以外の方法でもアミロイドβによる神経細胞死について評価を行い、アポトーシス細胞に特徴的なcaspase-3の活性化やPARPの断片化などが観察され、アミロイドβが神経細胞にアポトーシスを誘導することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
アミロイドβによる神経細胞障害活性測定の安定的な測定に予想以上の時間がかかった。そのため、硫化水素や硫化水素ドナーによる神経細胞保護効果があるかの検証をすることができていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
硫化水素や硫化水素ドナーによる神経細胞保護効果があるかの検証を行う。研究を遂行する過程で当初検討していた手法では安定的に細胞傷害活性を示すアミロイドβを調製することが困難であった。そのため、細胞に添加するアミロイドβの調製方法の最適化や細胞毒性評価方法の変更をおこなったため、年度内の研究完了ができなくなった。研究計画を見直し、アルツハイマー病モデルマウスを用いた実験ではなく、細胞を用いた実験により食品成分の神経細胞保護効果の評価を行うことにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
アミロイドβを使用したin vitroの実験条件の最適化を中心に行ったため、消耗品の支出が少なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度はこれまで使用していたPC12細胞に加えて、より生体に近い細胞モデルとしてラット初代培養神経細胞を用いて実験を行う。そのため神経細胞培養に必要な栄養因子（N2サプリメント）や脳組織を消化し細胞を分散させるために必要な酵素の購入に使用する。
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