研究課題/領域番号 |
25505008
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研究種目 |
基盤研究(C)
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研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
研究代表者 |
長崎 弘 藤田保健衛生大学, 医学部, 准教授 (30420384)
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研究分担者 |
須賀 英隆 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (20569818)
小谷 侑 藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (60644622)
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研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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キーワード | 間脳視床下部 / 視床下部機能障害 / 再生医療 / マウス胚性幹細胞 / 中枢性肥満 |
研究概要 |
間脳視床下部領域の脳腫瘍は、視床下部性肥満,下垂体調節障害による低身長、睡眠障害、尿崩症など多様かつ重篤な視床下部機能障害をきたす。2008年に開発されたマウスES細胞から視床下部細胞系への分化誘導法により、バゾプレシン、オレキシン、αMSH、NPY等多様な視床下部ペプチド細胞の試験管内再生が可能になった。本研究では視床下部領域破壊動物を疾患モデルとし、ES-hypoを移植して治療効果の確認を行うことにより、再生治療の技術基盤の確立を目指す。H25年度は以下の視床下部障害モデル動物の作成を行なった。 -カイニン酸による定位的視床下部破壊モデル:脳定位手術によりラット視床下部においての特定の神経核を化学的に変性する。神経毒であるカイニン酸をマイクロシリンジポンプにより注入し、神経核を両側性に破壊した。それにより、腹内側核の破壊では、摂食量増加、肥満、外側野の破壊により、摂食低下、体重低下の効果が見られた。 –GTG(金硫化グルコース)投与による視床下部破壊:GTG (300mg/kg体重)をマウスの腹腔内投与により、腹内側から弓状核への繊維連絡が破壊した。この方法は上記の脳定位手術より簡便に、選択的な視床下部破壊できるためマウスでの実験が可能になった。摂食量、飲水量、体重血糖値等の生理的指標のモニタリングにより視床下部障害を定量的に評価した。GTGマウスでは摂食量および体重が対照に較べて20%程度増加が見られた。この方法で、簡易に視床下部障害モデルマウスが作成できることを確認できた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一年目の目標である、視床下部障害モデル動物の作製が予定通り可能になった。
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今後の研究の推進方策 |
本年度は細胞移植法の開発である。計画書通り、ES-hypoの移植方法の開発を行い、宿主組織における細胞生着率、移植後ペプチド発現の検討を行なう。 移植法の検討として、中枢性尿崩症の再生治療においてすでに確立ている方法に準じる。SFEBq法でマウスES細胞を培養、視床下部ニューロンが発生した頃に細胞を分散。疾患モデル動物に対し、脳定位手術で26Gカニューラを穿刺、インフージョンポンプにより懸濁した細胞を投与する。 細胞培養:移植後の組織学的検討のため、GFP発現マウスES細胞株を用いる。SFEBq法でスフェロイドを培養、14日目よりCNTFなどの成長因子を加えてメンブレン培養する。25日目を過ぎると順次バゾプレシン、MCH、オレキシンなど背外側の神経核に局在する神経ペプチドの発現が増加してくる。NPY,POMCなど腹側の神経核に存在するニューロンに分化させるには、培養4日目よりソニックヘッジホッグ(Shh)を加える。メンブレン上の細胞塊をROCK阻害剤存在下に、パパインなどを含む神経細胞溶解液で分散し、細胞数を計測する。 細胞移植:脳定位手術によりシリンジを穿刺、懸濁した細胞を数十万個を注入する。対照群には生理食塩水を注入する。ラットへの移植後には拒絶反応抑制のためタクロリムスを経口投与する。GFP陽性の移植細胞の生着率およびそのペプチド発現を経時的に検討する。
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