| 研究課題/領域番号 |
25513002
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
黒野 定 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 招へい准教授 (20271554)
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| 研究分担者 |
檜枝 美紀 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教(常勤) (00380254)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | グライコミクス / グライコプロテオミクス / プロテオミクス / 二次元LC/MS / 絶対定量 / 選択反応モニタリング(SRM) / 安定同位体ラベル |
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| 研究実績の概要 |
2D LC-MS/MS を用いたプロテオミクス、グライコミクスより、乳頭分泌液 (nipple discharge, ND) 中の（糖）タンパク質の網羅的同定解析と双方における発現差異解析を行い、新規な乳癌タンパク質腫瘍マーカーを探索すると共に、当該マーカーの抗体を用いた酵素免疫 (EIA) を実施し、乳癌の（糖）タンパク質マーカー候補の選択を実施した。本年度は ND 検体計１１検体を受領し、現在の検体総数は１１５検体となった。これらの検体の内、乳癌検体１６種、そして、非癌検体１２種を用いた 2D LC-MS/MS 結果より、後者と比較して前者からより多く検出されたタンパク質３種を見出した。現在、これら３種の乳癌マーカー候補タンパク質の研究結果を科学雑誌に投稿すべく論文を投稿した (Proteomics Clinical Applications)。また、糖タンパク質ホルネリンについては、２部位の合成ペプチドを各々ウサギに免疫した抗体を作製し、ELISA 法により各抗体とも免疫ペプチドに対して高い反応性が確認された。しかしながら、免疫沈降 (IP) 法による抗原精製が可能となるほどの反応性は得られなかった。
さらに、乳癌マーカー候補タンパク質の確度を高めるため、ヨードアセトアニリド (IAA) 及びその 13C 同位体置換 IAA を用いた溶液中のタンパク質の選択反応モニタリング (selected reaction monitoring, SRM) 絶対定量質量分析法を開発し、それらの結果を論文にまとめ投稿しパブリッシュされた (Kurono, S. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 25, 1110-1116 (2015))。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ND検体の採取数は１１検体と予想よりも少なかったものの、その内８検体が乳癌検体であったため、癌検体中のタンパク質解析がより多く実施でき、より確度の高い乳癌マーカー候補の絞り込みが可能となった。従って、それらの結果を Proteomics Clinical Applications 誌に投稿することができた。さらに、糖タンパク質ホルネリンの抗体作製も進んでおり、糖タンパク質の免疫沈降実験等による糖鎖解析の道筋を作ることが出来た。また、溶液中のタンパク質の SRM 絶対定量質量分析法を開発し、それらの結果が Bioorg. Med. Chem. Lett. 誌に掲載されたため、研究の進捗はおおむね順調に進展していると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
乳癌患者の ND 検体の採取数を増やすため、検体採取機関との連携をさらに強めていく。そして、更なる糖タンパク質の網羅的な発現差異解析及び糖鎖構造解析プラットホームを構築し、乳癌腫瘍マーカー候補糖タンパク質の更なる解析を実施する。、
また、より親和性が強い抗ホルネリン抗体を作製し、免疫沈降実験、ナノ LC(HILIC)-MSn(CID/ETD)、糖鎖構造解析ソフトウエア（GlycoQuest）を用いた糖鎖構造及び糖鎖結合位置解析、を実施し、乳癌患者検体に特徴的な糖鎖構造を解析する。
そして、先行研究で見出された３種のタンパク質マーカー、及び、糖タンパク質マーカーの安定同位体ラベル化試薬 13C7-IAA を用いた新規な（糖）タンパク質絶対定量解析を実施し、さらに、臨床検体での臨床評価を行い、簡易アッセイ系の実用化への道をつける。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度の糖タンパク質ホルネリンの抗体作製において最適な抗体が未だできていないため、及び、タンパク質の絶対定量における未測定のタンパク質の合成ペプチドが作製できていないため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記２つの理由におけるそれぞれの作製費に充当する計画である。
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