研究課題
近年、TALENs、CRISPRといったゲノム編集技術が注目されている。TALENsはDNAに特異的に結合するドメインと、制限酵素Fok Iの切断ドメインを連結させたキメラタンパク質であり、この人工ヌクレアーゼによりゲノムDNAに二重鎖切断を導入する。一方、CRISPRはDNAに特異的に結合するguideRNAとよばれるキメラRNAが標的配列結合しそれを認識してCas9というDNA切断タンパクが結合しゲノムDNAに二重鎖切断を導入する。この二重鎖切断が、非相同末端結合により修復されると、高頻度に当該遺伝子に突然変異が導入される為、新たな遺伝子ノックアウト手法として用いられている。本申請では、DNA切断活性を転写制御活性に置き換えることにより人工転写因子を作成し、特定遺伝子の転写オン・オフを制御できる系をメダカにおいて確立する事を目指す。本技術の標的遺伝子としてp21遺伝子をとりあげ、個体レベルでの損傷応答シグナル経路解析の優れたモデル系の構築につながる事を期待している。昨年度TALENs、CRISPRで標的配列に効率よく変異を導入できることが確かめられたのでこれらのシステムを改変し人工転写制御因子の作製を行った。ターゲッティングベクターの作製が容易なCRISPRでシステム構築を行った。p21の上流領域にいくつかの標的配列を設定しgRNA発現ベクターを作成した。また人工転写制御因子としてDNA切断活性を失活させた変異Cas9と転写活性化因子VP16を4つ繰り返し並べたVP64とのキメラ蛋白質が人工転写因子として機能するかを確かめた。
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