| 研究課題/領域番号 |
25550032
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
紙谷 浩之 愛媛大学, 理工学研究科, 教授 (10204629)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | DNA損傷 / 8-oxoG / 遠隔作用変異 |
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| 研究概要 |
(1) WRN ノックダウンの 8-oxoG:A 対誘発変異への影響
8-oxoG の変異誘発経路には2種類がある。1つは、DNA 中のグアニン塩基が直接酸化される経路であり、この経路に対する WRN ノックダウンの効果が観察されている。もう1つの経路は、ヌクレオチドプール中の dGTP が酸化されて生じる 8-oxo-dGTP が鋳型 DNA 中アデニン塩基に対して取り込まれる経路である。そこで、後者の経路に対する WRN ノックダウンの効果を調べた。変異経路の中間体である 8-oxoG:A 対を有するプラスミドを調製して WRN ノックダウン細胞に導入したところ、変異頻度が有意に低下した。従って、WRN が、8-oxo-dGTP が誘発する変異に対しては促進的に作用することを明らかとした。
(2) DNA pol λ ノックダウンの8-oxoG:A対誘発変異への影響
上記の実験と同様に、DNA pol λ をノックダウンした細胞に対して、8-oxoG:A 対を有するプラスミドを導入したところ、変異頻度が有意に低下した。従って、DNA pol λ も 8-oxo-dGTP が誘発する変異に対しては促進的に作用することを明らかとした。また、この結果から、WRN と DNA pol λ の関連が強く示唆された。
(3) WRN と DNA pol λ のダブルノックダウン
WRN と DNA pol λ の ダブルノックダウンを行うために、両遺伝子に対する siRNA を導入してウエスタンブロットにより蛋白質量の減少を調べたが、シングルノックダウンの条件に比較してノックダウン効率が減少している（標的蛋白質が残存している）画像が得られた。この条件下で、8-oxoG:C 対を有するプラスミドを導入したところ、ダブルノックアウトの場合のみで変異誘発能の上昇が観察された。原因として、ウエスタンブロットの結果から示されるように、残存する WRN、DNA pol λ 両タンパク質の量が多いために明確な結果が得られなかった可能性が高い。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
WRN と DNA pol λ のダブルノックダウン実験に関しては、予定通りには進捗しなかったが、WRN ノックダウンの 8-oxoG:A 対誘発変異への影響やDNA pol λ ノックダウンの8-oxoG:A対誘発変異への影響を調べる実験によって、WRN と DNA pol λ の関連を強く示唆する結果が得られたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
Cas9の実験系を用いて WRN と DNA pol λ のシングル/ダブルノックアウト細胞を作製し、両蛋白質の遠隔作用変異への影響を明らかにする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
プラスチック製品などの消耗品は可能な限りキャンペーン品を購入することなどを徹底したことより、進捗には全く影響を与えずに、残額が生じた。
次年度の補助金と合わせることにより、やや高価なキットを購入することができるようになるため、研究を予定より進捗させることができるようになると思われる。
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