| 研究課題/領域番号 |
25550036
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| 研究機関 | 名城大学 |
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研究代表者 |
岡本 誉士典 名城大学, 薬学部, 助教 (50512323)
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| 研究分担者 |
小嶋 仲夫 名城大学, 薬学部, 教授 (80333178)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ＤＮＡ損傷 / 配列特異性 / 紫外線照射 / マウス胚性幹細胞 / 未分化因子 / シクロブタン型ピリミジンダイマー |
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| 研究実績の概要 |
前年度に検討した抗ＢＰＤＥ－ＤＮＡ抗体に加えて、新たに別のＢＰＤＥ－ＤＮＡ抗体および紫外線照射により生成するシクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）に対する抗体を検討した。その結果、抗ＣＰＤ抗体のみきわめて良好にＤＮＡ損傷を認識できることが明らかとなった。この抗ＣＰＤ抗体を用いて、強度の異なるＵＶＣ（１０あるいは１００ｍＪ／ｃｍ２）の照射で生成するマウス胚性幹細胞のゲノムＤＮＡ損傷を継時的に測定した。低照射群では、ＵＶＣ照射直後からＣＰＤ量が上昇し、２４時間後にはほぼ完全に修復が完了していた。一方、高照射群では、照射直後に低照射群と比べておよそ２倍のＣＰＤ生成が認められ、２４時間後にはおよそ半分が除去されていた。この時、マウス胚性幹細胞の未分化状態の維持に関連している因子の発現レベルをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により測定した結果、ＵＶＣ照射後３時間に発現低下が認められたが、ＣＰＤ量に相関するように２４時間後まで徐々に発現が回復した。したがって、今回の照射レベルにおいて、細胞の未分化状態に影響を及ぼすのに十分なＣＰＤが生成していると考えられる。このＵＶＣを照射したマウス胚性幹細胞からゲノムＤＮＡをマイクログラムオーダーで回収し、超音波破砕機によっておよそ１５０ｂｐとなるように断片化した。本断片化サンプルに対して、抗ＣＰＤ抗体を用いて免疫沈降法により損傷ＤＮＡを回収し、次世代シーケンサーによりＤＮＡ損傷配列特異性の確認を試みたが、シーケンシングに十分なＤＮＡ断片を回収することができなかった。したがって、研究期間を１年間延長し、抗体の反応特異性に依存しないＤＮＡ損傷の配列特異性を検出するための方法論について継続して検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでに良好な反応性を示すＤＮＡ損傷検出抗体［抗シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）抗体］を選定した。また、この抗ＣＰＤ抗体を用いてマウス胚性幹細胞に対するゲノムＤＮＡ損傷レベルおよび修復パターンを明らかにするとともに、未分化状態の決定因子の発現変動を明らかにできた。しかしながら、本課題の目的であるＤＮＡ損傷の配列特異性を明らかにするための免疫沈降反応を利用した次世代シーケンシングによるタイリング解析を試みたが、シーケンシングに十分な品質のＤＮＡ断片を調製することができなかったため、研究期間を１年間延長した。以上のことから、本課題は「やや遅れている。」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究において、複数回にわたってＵＶＣ照射によるＤＮＡ損傷配列特異性の解析を試みたが、シーケンスに適したＤＮＡサンプルの調製には至っていない。この原因として、ＤＮＡサンプルの調製が抗体反応に依存しているためであると考えられる。したがって、ＵＶＣ照射によるＤＮＡ損傷によってマウス胚性幹細胞のゲノムＤＮＡに導入された変異の配列情報をゲノムワイドに解析するなどの方法を用いて、ＤＮＡ損傷配列特異性の解析を試みていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２６年度内に実施を予定していた次世代シーケンシングの委託分析を予定していたが、サンプルの純度および濃度等に不備があり何度トライしても改善が見込めなかった為、その依頼分析自体を見直すこととなったため、繰越金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２７年度は、ＤＮＡのサンプリング条件を精査するとともに、解析手法の見直しを図り、年度内でのＤＮＡ損傷配列特異性の解明を試みる。
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