| 研究課題/領域番号 |
25550038
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 公益財団法人放射線影響研究所 |
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研究代表者 |
野田 朝男 公益財団法人放射線影響研究所, 遺伝学部, 副部長(研究員) (40294227)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 放射線損傷 / ストレス応答 / DSB / unrepairable damages |
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| 研究概要 |
本研究は、放射線被ばくにより生じるゲノム損傷(DNA double strand breaks:DSB)のうち、いつまで経っても修復されない傷の特徴付けを行い、これらが損傷のうちの大部分を占める修復可能なDSBと生化学的にどう異なるか解明する事を目的としている。平成２５年度は、網羅的な遺伝子発現の解析からの特徴付けアプローチと、修復不能な損傷を被った被ばく細胞に特異的に反応するモノクローナル抗体作製というアプローチを試みた。
10 Gy照射後１ヶ月培養したヒト正常線維芽細胞と非照射細胞、および1 Gy照射後１時間培養した細胞からtotal RNAを抽出してAgilent社のヒトexpression microarray(SurePrint G3 Human Gene Expression Array)にて全発現遺伝子を網羅的に解析した。10 Gy照射細胞のみで発現している遺伝子を絞り込み、核蛋白質である可能性（核移行ドメインを持つか、クロマチン蛋白質ドメインを持つか、DNA結合ドメインを持つか、核膜、核膜孔蛋白質であるか等）でさらに候補遺伝子を絞り込み、10個以内の遺伝子を今後の解析の対象とした。これらの遺伝子中には、放射線ストレス応答に関わると考えられる新規の遺伝子（蛋白質）が含まれる可能性が出てきた。
10-30 Gy照射後１ヶ月以上培養したヒト正常線維芽細胞から核蛋白質の粗抽出液を作製し、これを用いてBalb/cマウスを繰り返し抗原刺激して免疫し、これらの脾臓リンパ球からマウスハイブリドーマ・ライブラリーの作製を試みた。10万クローンほどのハイブリドーマクローン・ライブラリーの作製が目標であり、本年度は大規模ライブラリー作製の予備段階まで到達した（数千クローンのライブラリー作製）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
放射線被ばくにより生じるゲノム損傷のうち、いつまでも修復されずに細胞に留まるDSB損傷を特異的に検出したい、と言うのが本研究の目的であり、研究計画として３つのアプローチを提案した。平成２５年度は最初のアプローチとしての遺伝子の網羅的発現解析を効果的に行い、修復不能なDSBを持った細胞で特異的に発現する遺伝子候補を絞り込むことができた。これらの候補遺伝子中から、放射線被ばくの生体影響を説明しうる遺伝子が新たに発見される可能性が期待される。
上述の遺伝子発現レベルからのアプローチと並行して、細胞核全蛋白質の網羅的解析も始めることができた。これは、修復不能なDSBを持つ細胞由来の全核蛋白質を抗原としてマウスモノクローナル抗体を作製するという挑戦的な試みであり、もし成功すればより直接的に放射線の被ばく影響を測定することが可能となる。マウスハイブリドーマ・ライブラリー作製の条件検討並びに目的抗体取得のためのスクリーニング方法の確立にもめどが立ってきた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.遺伝子の網羅的発現解析により得られた候補遺伝子について、それらの放射線被ばく細胞での機能解析を行う。蛋白質構造情報から、核内の局在、放射線照射に呼応した修飾（リン酸化、アセチル化、メチル化など）の有無、修復不能なDSBとの結合性について検討する。これらの核蛋白質に対する抗体を作製し、被ばく細胞中で修復不能な損傷を持った細胞を特異的に検出できるか否か検証する。これら蛋白質遺伝子のノックダウン、あるいはノックアウト細胞を作製する。
2.大規模なマウスハイブリドーマ・ライブラリーを作製し、修復不能な傷を持つ細胞のみと反応するモノクローナル抗体の取得を目指す。この作業は大変な労力を要するので、スクリーニングの自動化方法を確立する。
3.ハイブリドーマ・ライブラリーの網羅的スクリーニング解析と並行して、細胞核全蛋白質の網羅的解析のもうひとつの可能性を検討する。10 Gy照射後１ヶ月培養したヒト正常線維芽細胞と非照射細胞、および1 Gy照射後１時間培養した細胞由来の核全蛋白質（核蛋白質粗抽出液）を２次元のゲル電気泳動にて展開し、修復不能なDSBを持つ細胞に特異的な蛋白質spotを検出し、質量分析により蛋白質の同定を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
消耗品予定額の一部分（34円）が残り、これだけでは使い道が無いので次年度の消耗品の一部として使用する事とした。
翌年度予算と合わせて、滅菌ピペット購入に使用する。
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