研究課題
バクテリアの細胞内情報伝達の手段に蛋白質のヒスチジン残基（ヒスチジンキナーゼ）とアスパラギン酸残基（レスポンスレギュレーター）のリン酸化を介した２成分システムがある。しかし，これらの残基に結合したリン酸基は化学的に不安定であるため，この系におけるリン酸化研究の手法は限られ，速度論的な解析についての報告はこれまでにほとんどない。本研究では，申請者が独自に開発・改良したリン酸親和性電気泳動法を，この不安定なリン酸化蛋白質を介する２成分情報伝達系の研究に応用し，リン酸基転移反応やそれらの複雑なクロストークの解明のための，さらには，ヒスチジンキナーゼ（HK）阻害剤の開発のための動的定量解析手法として発展させることを目的とした。当該年度においては，前年度の成果をもとに大腸菌由来のハイブリッド型HK, EvgSについて，in vivo におけるリン酸基転移反応の制御機構をフォスタグSDS-PAGEを用いて検証した。以下に成果を記述する。全長のevgS遺伝子を大腸菌内発現ベクターにクローニングしたpBADevgSを作成した。さらに，それぞれのリン酸部位にAla置換を導入した，pBADevgS-H721A, -D1009A, -H1137Aを作成した。これら４種の発現ベクターを細胞内因性EvgSを欠損させた大腸菌に形質転換し，それぞれ野生型EvgSと３種のAla変異タンパク質を発現させた。EvgSの活性化は，0.1 M KCl を含む M9 最小培地において，pHを７か5.5に低下させることで行った。その結果，前年度の in vitro の解析同様に，変異体 D1009A の自己リン酸化反応において，H721 の過剰なリン酸化フォームを検出することができ，前年度の in vitro における速度論的成果を in vivo においても再現することができた。
2: おおむね順調に進展している
前年度に得られた in vitro リン酸化反応における速度論的成果が，in vivo の反応においても相関することを実証することができた。これにより，ハイブリッド型HKにおけるレシーバードメインの重大な生理機能を示唆することができた。すなわち，レシーバードメイン内に存在するD1009残基が，レスポンスレギュレーターに転移させるリン酸化量を積極的にネガティブ制御していることである。このように，２成分伝達系におけるハイブリッド型HKの複雑なリン酸基転移反応の必要性を考察するうえで，フォスタグSDS-PAGEを用いた定量解析は，重要な示唆を与えた。今後の展開に期待できる。
前年度，並びに当該年度の研究成果により，EvgSのD1009A変異体の自己リン酸化反応が１次反応速度論で解析できることが明らかとなった。申請者が独自に開発・改良したリン酸親和性電気泳動法であるフォスタグSDS-PAGEは，リン酸化体とそれに相当する非リン酸化体とを異なる泳動バンドとして同時に視覚化できるので，さらに詳細で，かつ，高精度な阻害剤スクリーニングが可能になると考えている。また，反応中に起こる酵素や基質の分解等の副作用も検出できると期待している。具体的に以下の項目等を検討する。・一般的なキナーゼ阻害剤（ATP類似化合物）等を用いた濃度依存的な影響について・上記の化合物が与えるリン酸化反応以外の影響（分解等の副作用）についてリン酸化体と非リン酸化体の比率からリン酸化抑制の動的定量を試みるとともに，その反応が純粋なものであるか（酵素や基質の分解反応といった分子量が変化するような反応が起きていないか）を検証する。
旅費や謝金に予定していた予算が削減でき，次年度使用額が生じた。
３年目はさらに研究が展開されるので，次年度使用額208,549円とH27年度予算を合わせて，旅費や謝金に大いに活用させていただき，研究を効率よく進める予定である。
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