創薬研究を指向したバクテリア２成分情報伝達系に関する動的定量解析手法の樹立

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25560417
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 木下 英司 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 准教授 (80304418)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: フォスタグ / 2成分伝達系 / ヒスツジンキナーゼ / レスポンスレギュレーター / 生体分子計測

研究実績の概要

バクテリアの細胞内情報伝達の手段に蛋白質のヒスチジン残基(ヒスチジンキナーゼ)とアスパラギン酸残基(レスポンスレギュレーター)のリン酸化を介した2成分システムがある。しかし，これらの残基に結合したリン酸基は化学的に不安定であるため，この系におけるリン酸化研究の手法は限られ，速度論的な解析についての報告はこれまでにほとんどない。本研究では,申請者が独自に開発・ 改良したリン酸親和性電気泳動法を，この不安定なリン酸化蛋白質を介する2成分情報伝達系の研究に応用し，リン酸基転移反応やそれらの複雑なクロストークの解明のための，さらには，ヒスチジンキナーゼ(HK)阻害剤の開発のための動的定量解析手法として発展させることを目的とした。当該年度においては，前年度の成果をもとに大腸菌由来の３種のハイブリッド型HKについて，in vitro におけるリン酸基転移反応の様式をフォスタグSDS-PAGEを用いて検証した。その結果，ArcB，EvgS，BarAのリン酸基転移反応の様式はそれぞれ，cis-trans-trans，cis-cis-cis，trans-trans-transであり，３種３様であることが判明した。さらには，HK阻害剤の開発を目的として，EnvZのHisリン酸化阻害活性を持つ植物エキスのスクリーニングを行った。その結果，ハマセンナ（Ormocarpum cochinchinese）の抽出エキスにリン酸化阻害活性が見出された。続いて，溶媒分配，逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー等を用い，その活性成分を探索したところ，新規化合物の単離に成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Validation of cis and trans modes in multistep phosphotransfer signaling of bacterial tripartite sensor kinases by using Phos-tag SDS-PAGE. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, Eguchi, Y., Koike, T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11 ページ: e0148294
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0148294.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Expression and phosphorylation state analysis of intracellular protein kinases using Multi-PK antibody and Phos-tag SDS-PAGE. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, Y., Katayama, S., Kameshita, I., Morisawa, K., Higuchi, T., Todaka, H., Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., Koike, T., Taniguchi, T., Sakamoto, S.
  • 雑誌名: MethodsX 巻: 2 ページ: 469-474
  • DOI: 10.1016/j.mex.2015.11.007.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The cutting edge of affinity electrophoresis technology. (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomes 巻: 3 ページ: 42-55
  • DOI: 10.3390/proteomes3010042
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Advances in Phos-tag-based methodologies for separation and detection of the phosphoproteome. (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta 巻: 1854 ページ: 601-618
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2014.10.004.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Phos-tag SDS-PAGE ゲルからの標的リン酸化タンパク質の転写効率改善． (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 雑誌名: 分析化学 巻: 64 ページ: 501-509
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] ハイブリッドセンサーキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構 ～レシーバードメインによるリン酸化レベルの負の制御機能～ (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGEを用いたリン酸化阻害物質の探索 (2016)
  • 著者名/発表者名: 曽根雄太郎，山野喜，志賀もえみ，杉本幸子，木下英司，木下恵美子，小池透，大塚英昭，松浪勝義
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [学会発表] Thio-tag Tipを用いたチオール基含有化合物の選択的分離精製法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 草本寛，藤岡晴人，是竹紀尚，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [学会発表] Development of Thio-tag magnetic bead for rapid and selective separation of thiol-containing biomolecules (2015)
  • 著者名/発表者名: Maho Kawaguchi, Norinao Koretake, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: Pacifichem2015
  • 発表場所: 米国，ホノルル市
  • 年月日: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • 国際学会
• [学会発表] Phos-tag technology for profiling of protein phosphorylation: principle and application (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸市
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] ハイブリッドセンサーキナーゼのリン酸基リレー情報伝達機構におけるレシーバードメインの制御機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子，木下英司, 江口陽，吉多美祐，山本兼由，内海龍太郎，小池透
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸市
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGEゲルからの標的リン酸化タンパク質の転写効率の改善 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司、草本寛、木下恵美子、小池透
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
• [学会発表] リン酸基捕捉能を持つダーククエンチャーを用いた蛍光分析法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 國貞夏実、木下恵美子、木下英司、小池透
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するためのPhos-tag Tipの開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 河口真歩、井野洋子、木村弥生、平野久、木下恵美子、木下英司、小池透
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
• [学会発表] Phos-tagビーズを用いたゲル内消化産物からのリン酸化ペプチド濃縮 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井野洋子、木下英司、木下恵美子、小池透、戸田年総、平野久、木村弥生
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
• [学会発表] Phos-tag tip, a novel tool for phosphoproteome study (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, Yoko Ino, Yayoi Kimura, Hisashi Hirano, Tohru Koike
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2015年大会
  • 発表場所: 熊本市
  • 年月日: 2015-07-23 – 2015-07-24
• [学会発表] フォスタグ (Phos-tag) 技術のノート ＆ チップ (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: アステラス製薬 バイオサイエンス研究所セミナー
  • 発表場所: つくば市
  • 年月日: 2015-07-10
  • 招待講演
• [学会発表] リン酸化プロテオーム研究のための Phos-tag テクノロジー： サンプル前処理技術としての貢献 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 宮崎大学農学部プロテオミクス教育セミナー
  • 発表場所: 宮崎市
  • 年月日: 2015-06-19
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質のリン酸化を見える化する技術：フォスタグテクノロジー (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 山口大学 医学部 「基盤系特別専門講義」
  • 発表場所: 宇部市
  • 年月日: 2015-05-25
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質リン酸化解析のための Phos-tag テクノロジー (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 広島大学大学院医歯薬保健学研究院基礎生命科学部門 公開セミナー
  • 発表場所: 広島市
  • 年月日: 2015-04-23
• [図書] Phosphopeptide detection with biotin-labeled Phos-tag, in Phospho-proteomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 1355 (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 総ページ数: 13
  • 出版者: Springer
• [図書] Neutral phosphate affinity SDS-PAGE system for profiling of protein phosphorylation, in Proteomic Profiling: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 1295 (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 総ページ数: 32
  • 出版者: Springer
• [図書] Phos-tag-based affinity chromatography techniques for enrichment of the phosphoproteome, in Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling. (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 総ページ数: 14
  • 出版者: Springer
• [図書] Phos-tag technology for kinomics, in Kinomics: Approaches and Applications. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 総ページ数: 16
  • 出版者: Wiley-VCH
• [備考]
  • URL: http://seeds.office.hiroshima-u.ac.jp/profile/ja.029d4be16466a63c520e17560c007669.html
• [備考]
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [備考]
  • URL: http://shushoku-signal.com/soshiki/kobo/18kinoshita.html