| 研究課題/領域番号 |
25560420
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| 研究機関 | 成蹊大学 |
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研究代表者 |
戸谷 希一郎 成蹊大学, 理工学部, 准教授 (80360593)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | エンドマンノシダーゼ / 糖タンパク質品質管理 / カルネキシンサイクル / 合成糖鎖プローブ |
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| 研究実績の概要 |
今年度は標的酵素の基質特異性解析とクローニング、および局在解析を行った。
我々が以前に合成した多様な高マンノース型蛍光糖鎖を基質とした糖鎖特異性解析の結果、本酵素は非還元末端にGlcを３残基、２残基および１残基もつ糖鎖のいずれに対してもエンド型の糖加水分解活性を有することが明らかとなった。またその特異性はGlc1Man9GlcNAc2>Glc2Man9GlcNAc2>Glc3Man9GlcNAc2 の順であった。一方、Glc1Man9GlcNAc2の還元末端に様々なアグリコン構造を導入した基質に対して、本酵素のアグリコン特異性解析を行ったところ、本酵素は疎水性の高いアグリコン構造をもつ基質を選択的に加水分解することが分かった、アグリコン構造の疎水性が高い基質は変性糖タンパク質のモデルと解釈することができるため、本酵素は変性糖タンパク質を選択的にカルネキシンサイクルから離脱させる重要な駆動力になるものと示唆される。
また別途ゲノム情報から本酵素活性の活性本体と示唆される候補をタグ付きタンパク質としてクローニングし、安定発現株を樹立した。当該遺伝子を導入した細胞内から当該タンパク質を精製し、その酵素活性を確認したところ、期待される酵素活性を示す初期的知見を得たことから、本酵素の同定を概ね達成したものと考えている。さらに本酵素を蛍光標識し、蛍光顕微鏡にて細胞内局在を精査したところ、小胞体に局在していることが分かった。これらの結果は我々の仮説を支持するものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
若干、当初計画と研究方法に変更があったが、達成した研究成果としては計画通りであるため。
また本研究で取り扱う酵素と恊働して糖タンパク質品質管理を制御すると考えられるUGGTおよびカルレティキュリンの特異性解析やシャペロン活性分析法に関する研究成果と論文として発表できたため、最終年度に向けて期待する成果を得るための基盤が整えられつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
クローニングした酵素候補について詳細な特異性解析によって、我々が発見した酵素と同一のものであるか検証する。また本酵素の小分子基質を合成し、広範な機能性解析に適用し、その性質を明らかにする。
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