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2014 年度 実績報告書

マイクロチップ上での遺伝子導入と1細胞追跡を用いた細胞初期化・分化の研究

研究課題

研究課題/領域番号 25600056
研究機関東京大学

研究代表者

鷲津 正夫  東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10201162)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2015-03-31
キーワードマイクロ・ナノテクノロジー / エレクトロポレーション / マイクロチップ / 再生医療 / 静電気 / 遺伝子導入 / 細胞周期
研究実績の概要

本研究は,マイクロチップ上での遺伝子等導入技術と,高感度測定技術の組み合わせにより,体細胞のiPS 化を,細胞非侵襲的に1細胞レベルで経時追跡することにより,その過程の細胞周期との関連を可視化解析するとともに,履歴が明らかな細胞クローンを得る新手法を開発することを目的として行った。
まず,直径3μm間隔20μmのオリフィスシートを微細加工技術により作製,細胞を播種,細胞がオリフィスシート表面に十分に接着するまでインキュベータ内で培養した。これにより,付着したほぼすべての細胞の核の下に,少なくとも1つのオリフィスがあるような状況が実現できる。ここにパルス電圧を与えると,電気泳動によりプラスミドが核に直接送り込まれる。
Hela細胞およびTIG細胞を用いて,GFPプラスミドを導入したところ,いずれにおいても1.5時間程度後から発現が見られることを確認した。次に,細胞周期依存的な蛍光色を発する細胞(HeLa/Fucci細胞)を用いて,細胞周期と遺伝子発現・初期化の関連について研究を行った。GFPプラスミドは, Fucciが緑色のタイミング(S期からG2期)とFucciが赤色のタイミング(G1期)の両者でほとんどが発現をし,Fucciが赤色のタイミング(G1期)での発現は希であった。
次に,山中因子/GFPプラスミドを用いて遺伝子導入を行ったところ,S期~M期で周期を停止する細胞が,山中因子を含まない場合に比べて有意に多く観察された。また, Oct3/4の抗体染色を行ったところ,約70%の細胞でGFP発現とOct3/4発現が一致しているという結果が得られた。これらの実験結果より, S期~M期での細胞周期停止は山中因子の導入・発現により誘発されたものであるらしいと分かった。
これらの結果は,タイミングを制御して遺伝子を導入し,その後を経時的に観察できる,我々の手法があって始めて得られる知見である。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2014 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] オンチップエレクトロポレーションを用いた接着細胞核への遺伝子直接送達法の開発2014

    • 著者名/発表者名
      黒澤修・オケヨ ケネディ オモンディ・小穴英廣・沖田圭介・小寺秀俊・鷲津正夫
    • 雑誌名

      静電気学会誌

      巻: 38-1 ページ: 28-33

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Subcellular glucose exposure biases the spatial distribution of insulin granules in single pancreatic beta cells2014

    • 著者名/発表者名
      Kyohei Terao, Murat Gel, Atsuhito Okonogi, Ariko Fuke, Teru Okitsu, Takashi Tada, Takaaki Suzuki, Shinya Nagamatsu, Masao Washizu & Hidetoshi Kotera
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 4 : 4123 ページ: 1-6

    • DOI

      10.1038/srep04123

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Non-destructive handling of individual chromatin fibers isolated from single cells in a microfluidic device utilizing an optically driven microtool2014

    • 著者名/発表者名
      Hidehiro Oana, Kaori Nishikawa, Hirotada Matsuhara, Ayumu Yamamoto, Takaharu G. Yamamoto, Tokuko Haraguchi, Yasushi Hiraokade and Masao Washizu
    • 雑誌名

      Lab Chip

      巻: 2014 ページ: 696-704

    • DOI

      10.1039/c3sm00089c

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] オンチップエレクトロポレーションを用いた接着細胞核への遺伝子直接送達法の開発2014

    • 著者名/発表者名
      オケヨ ケネディ・西垣内康宏・近藤武宏・黒澤修・小穴英廣・小寺秀俊・鷲津正夫
    • 雑誌名

      静電気学会誌

      巻: 38-1 ページ: 40-45

    • 謝辞記載あり
  • [学会発表] Narrowing slit device for high yield one-to-one electrofusion and culture of fusants without gene mixing2014

    • 著者名/発表者名
      S. Sakamoto, K. O. Okeyo, O. Kurosawa, H. Oana, H. Kotera and M. Washizu
    • 学会等名
      IEEE MHS2014
    • 発表場所
      Nagoya, Nagoya Univ.
    • 年月日
      2014-11-09 – 2014-11-12
  • [学会発表] Generation of epithelial cell sheets with defined cell orientation using microstructured mesh sheets as a substrate for cell culture2014

    • 著者名/発表者名
      K.O. Okeyo, R. Yanaru, O. Kurosawa, H. Oana, H. Kotera, and M. Washizu
    • 学会等名
      µTAS2014
    • 発表場所
      San Antonio, Texas, USA
    • 年月日
      2014-10-26 – 2014-10-30
  • [学会発表] Cytoplasmic transfer without nuclei mixing between dentritic cells and tomour cells achieved by one-to-one electrofusion via microorifices in a microfluidic device2014

    • 著者名/発表者名
      Yutaro Itagaki, Kennedy O. Okeyo, Osamu Kurosawa, Hidehiro Oana, Miwako Narita, Hidetoshi Kotera, and Masao Washizu
    • 学会等名
      µTAS2014
    • 発表場所
      San Antonio, Texas, USA
    • 年月日
      2014-10-26 – 2014-10-30
  • [学会発表] Biomanipulation, cell fusion, single-cell surgery2014

    • 著者名/発表者名
      Masao Washizu
    • 学会等名
      8th International Workshop on Approaches to Single-Cell Analysis
    • 発表場所
      Nairobi, Kenya
    • 年月日
      2014-09-08 – 2014-09-10
    • 招待講演
  • [備考] 東京大学大学院工学系研究科 鷲津・小穴研究室

    • URL

      http://www.washizu.t.u-tokyo.ac.jp/

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公開日: 2016-06-01  

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