| 研究実績の概要 |
本研究は，マイクロチップ上での遺伝子等導入技術と，高感度測定技術の組み合わせにより，体細胞のiPS 化を，細胞非侵襲的に１細胞レベルで経時追跡することにより，その過程の細胞周期との関連を可視化解析するとともに，履歴が明らかな細胞クローンを得る新手法を開発することを目的として行った。
まず，直径3μm間隔20μmのオリフィスシートを微細加工技術により作製，細胞を播種，細胞がオリフィスシート表面に十分に接着するまでインキュベータ内で培養した。これにより，付着したほぼすべての細胞の核の下に，少なくとも1つのオリフィスがあるような状況が実現できる。ここにパルス電圧を与えると，電気泳動によりプラスミドが核に直接送り込まれる。
Hela細胞およびTIG細胞を用いて，GFPプラスミドを導入したところ，いずれにおいても1.5時間程度後から発現が見られることを確認した。次に，細胞周期依存的な蛍光色を発する細胞（HeLa/Fucci細胞）を用いて，細胞周期と遺伝子発現・初期化の関連について研究を行った。GFPプラスミドは， Fucciが緑色のタイミング（S期からG2期）とFucciが赤色のタイミング（G1期）の両者でほとんどが発現をし，Fucciが赤色のタイミング（G1期）での発現は希であった。
次に，山中因子/GFPプラスミドを用いて遺伝子導入を行ったところ，S期～M期で周期を停止する細胞が，山中因子を含まない場合に比べて有意に多く観察された。また， Oct3/4の抗体染色を行ったところ，約70%の細胞でGFP発現とOct3/4発現が一致しているという結果が得られた。これらの実験結果より, S期～M期での細胞周期停止は山中因子の導入・発現により誘発されたものであるらしいと分かった。
これらの結果は，タイミングを制御して遺伝子を導入し，その後を経時的に観察できる，我々の手法があって始めて得られる知見である。
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