| 研究課題/領域番号 |
25630378
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
藤山 和仁 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 教授 (70209112)
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| 研究分担者 |
大橋 貴生 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 助教 (10597876)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 糖鎖 / 大腸菌 / 組み換えタンパク質 |
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| 研究概要 |
大腸菌内でヒト型糖鎖を合成する経路を創製する。
これまでCampylobacter jejuniJCM2013 (ATCC29428) より糖鎖修飾酵素オペロンを既に取得した。このオペロン構造は、既報のC. jejuniNCTC11168（Nothaft and Szymanski, 2010）に類似していた。今年度はまず、C. jejuni JCM2013の糖鎖修飾酵素オペロンおよびモデルタンパク質CmeAを大腸菌で発現させ、精製CmeAにおける糖鎖付加を調査した。まず、オペロンの各遺伝子の発現を確認した。その結果、CmeAのAsn残基に、(HexNAc)6(Hex)1からなる糖鎖が付加していた。酵素消化、LC-MS解析から、Asn‐HexNAc‐GalNAc‐GalNAc‐GalNAc (‐Glc)‐GalNAc‐GalNAc構造であると推測できた。既報では、Asn付加糖鎖は、bacillosamineであったが、我々の結果は大腸菌内で主たる構造としてAsn‐HexNAcを持つタンパク質生産が可能であることを示した。以上の成果を論文および学会発表した。
計画しているヒト型糖鎖合成経路のため必要な遺伝子5種類は、アーキア・バクテリア・真核生物（今回、出芽酵母）より取得した。取得遺伝子が、大腸菌内で可溶性かつ活性型で発現できるか確認した。一部、可溶化型タンパク質としての発現が見られなかったので、別の生物より遺伝子を取得し、その機能発現を調査した。
発表論文J Biosci Bioeng. 2014. pii: S1389-1723(14)00063-2. Identification of a protein glycosylation operon from Campylobacter jejuni JCM 2013 and its heterologous expression in Escherichia coli. Srichaisupakit A, Ohashi T, Fujiyama K
学会発表 日本農芸化学会2014年度大会 Identification of a protein glycosylation operon from Campylobacter jejuni JCM 2013. Srichaisupakit A, Ohashi T, Fujiyama K
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
大腸菌においてCampylobacter遺伝子発現を行い、モデルタンパク質に糖鎖を付加することに成功した。糖鎖構造は、当初予想していたものと異なり、本プロジェクトで目指す構造により近づいた結果となった。これら成果を、論文発表した（Srichaisupakit A, Ohashi T, Fujiyama K., J Biosci Bioeng. 2014 Mar 17. pii: S1389-1723(14)00063-2. doi: 10.1016/j.jbiosc.2014.02.011.）。
一部酵素について、大腸菌で可溶性画分として生産できたものの活性を十分に発現できていない。これらについては、引き続き活性型酵素タンパク質を生産できるよう試みる。また、同様の活性を示す別酵素遺伝子の発現も試みる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成25年度で調製した遺伝子を活用し、大腸菌でのヒト型糖鎖合成経路の創製と糖タンパク質生産を試みる。
まず、Man3GlcNAc2構造合成経路の構築を試みる。大腸菌に導入する必要のある遺伝子は、5種である。モデルタンパク質CmeAの糖鎖構造をLC-MSを用いて解析する。糖鎖修飾酵素の一部は、大腸菌で期待した活性を発現できない場合がある。その場合Man3GlcNAc2構造に近い構造の合成を試みる。
糖転移酵素PglBの基質特異性の詳細な解析がなされていない。上記の研究計画でもPglBはMan3GlcNAc2構造をモデルタンパク質CmeAに転移すると推定している。その後、GnTなどをさらに発現させ、ヒト型糖鎖GlcNAc2Man3GlcNAc2型糖鎖合成を試み、PglBがGlcNAc2Man3GlcNAc2型糖鎖をCmeAへ転移できるかどうか検証する。
多重遺伝子の導入方法として、(i) 染色体に組み込み1コピーとして存在させる、(ii)遺伝子(群)ごとに異なるプラスミドに乗せる、(iii)細胞内コピー数が異なるプラスミドを利用するなど多様な方策が考えられる。また、糖鎖合成、糖鎖転移に関わる酵素群を効率的に配置し、協奏的に機能できるように試みる。糖鎖構造合成の効率性などを指標に、遺伝子発現システムを評価し、より効率的なマシナリーを構築する。発現誘導プロモーター（lac, araプロモーター）の調整、遺伝子コピーの調整、などによる発現レベルの調整などを改良する。また、ヒト医療用組換えタンパク質（例えば、インターフェロン）の生産が可能か挑戦する。
以上より、ヒト型糖鎖を持つ組換え医療糖タンパク質生産に適した大腸菌を創製する。
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