研究課題
挑戦的萌芽研究
本研究課題では、生体イメージング法におけるマーカー遺伝子を利用し、ウイルスベクターによって導入した外来遺伝子の発現状態をモニターする手法を霊長類脳神経系で確立するとともに、同手法を特定の神経路を形成するニューロン群にのみ外来遺伝子を導入する神経路選択的遺伝子導入法に適用し、ターゲット神経路の活動を操作する機能介入解析をおこなう際に、遺伝子発現状態をモニターすることを可能にすることを目的としている。平成２５年度は、陽電子放射断層撮影（PET）のマーカー遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作製し、同ベクターをマカクザルの線条体に注入し、その発現状態をPETで検出できることを検証する実験をおこなった。その結果、PET撮像により線条体におけるマーカー遺伝子の発現がシグナルとして検出できることを確認し、組織学的解析をとおしてマーカー遺伝子の発現範囲とPETシグナル範囲が一致していることを確認した。また、タグ配列の導入によるPETシグナルへの影響について解析をおこなった。また、この手法を特定の神経回路に対する機能介入解析に応用するため、逆行性レンチウイルスベクターとAAVベクター、およびTet-On発現誘導系を利用した神経路選択的な遺伝子発現法に改良を加え、発現量の増加とリーク発現の低下を実現し、かつPETマーカー遺伝子、組織学的マーカー遺伝子、神経活動制御プローブ遺伝子など複数の遺伝子を発現できるシステムを開発した。また、ベクターシステムにRNAiによる発現抑制系を開発するためのベクター配列の改変をおこなった。
2: おおむね順調に進展している
平成２５年度の研究実施計画に記載した、生体イメージング用レポーター遺伝子の構築とウイルスベクター発現系による性状確認については、PETのマーカー遺伝子を導入したAAVベクターを用いて、マカクザルの線条体においてPET撮像によりマーカー遺伝子の発現をシグナルとして検出することに成功し、現在、最適化のためにタグ遺伝子の付加などについて検討をおこなっている。また、神経路選択的遺伝子導入ベクターシステムへのレポーター遺伝子の導入と最適化については、発現量の増加とリーク発現の低下を実現し、かつ複数の遺伝子を発現できるベクターシステムの開発に成功した。神経伝達物質受容体のRNAi誘導配列の構築についても、ベクターシステムの構築・検証実験が進行しており、全体として研究が順調に進展していると考えられるため。
研究計画は当初の予定どおり順調に進展していると考えられるため、平成２５年度に開発、改良に成功したレポーターシステムおよびウイルスベクターシステムを利用して、神経路選択的遺伝子導入ベクターシステムへのレポーター遺伝子の導入と最適化を実施し、レポーター遺伝子による発現状態の確認と、薬剤導入による特定の神経路への機能介入を同時に実現する実験系を構築するとともに、イメージング結果と行動学的および組織学的解析結果との相関を調べる。また、神経伝達物質受容体遺伝子をターゲットとして特定のニューロン群におけるRNAi誘導配列の転写状態を的確に推定できる手法の確立を目指して、ベクターの開発と改良、およびベクター注入後のイメージング実験を進める。
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