ノンコーディングＲＮＡによるヒトES細胞の神経分化制御機構の解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25640038
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 岡田 洋平 慶應義塾大学, 医学部, 訪問准教授 (30383714)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ヒトES細胞 / ノンコーディングRNA / 神経分化

研究概要

これまでの研究で、ヒトES細胞(KhES1,2,3)、ヒトiPS細胞(201B7, 253G1)から神経幹細胞を誘導する過程においてゲノムタイリングアレイによる転写産物解析を行い、ヒトES/iPS細胞の神経分化に伴って発現が上昇する、非翻訳領域にある転写産物の中で、特に発現量が高く、神経系特異的であると考えられる転写産物52個を同定してきた。従来の神経分化誘導法において、定量的RT-PCRにより、未分化状態に比べて、神経分化誘導後にこの52個の転写産物の発現が上昇していることを確認してきたが、さらに新たに開発した単層培養による迅速神経分化誘導法においても、このうち40個の転写産物の発現上昇がみられることを定量的RT-PCRにより確認した。そこで、これら40個の転写産物を初期の神経発生に重要なncRNAの候補として解析に用いることとした。
そこで、ヒトES細胞を単一細胞まで解離した段階で、これら約40個のターゲットに対するsiRNAをリポフェクション法、あるいはエレクトロポレーション法により導入したうえで迅速神経分化誘導を行い、siRNA導入後6日目に定量的RT-PCRにより、神経幹細胞マーカーであるhSOX1の発現解析を行っている。現在、神経分化の抑制効果（SOX1の発現抑制）を指標に、各店者産物がヒトES細胞の神経分化に与える影響を解析している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

単層培養による迅速神経分化誘導法における各転写産物の発現を確認することで、ターゲットとなる転写産物を絞り込むことができた。siRNAの導入によるスクリーニングを行っており、いくつか神経分化の抑制効果がみられるものもあるが、結果にばらつきがあり、さらに検証を必要とする。

今後の研究の推進方策

絞り込んだ40個の転写産物に対するsiRNAを用いて、迅速神経分化誘導法を用いたスクリーニングを続行する。
高効率に神経分化の抑制がみられた転写産物については、複数のsiRNA、あるいはshRNA, miRNAによる長期抑制を行い、同定された転写産物のValidationを行う予定である。

次年度の研究費の使用計画

効率的な物品調達が可能であったため、当初の予定に比べて、少ない量の物品費で研究の遂行が可能であったため。
次年度は、さらにスクリーニングを行うため、当初予定していたよりも多くの培養等の実験を必要とすると考えられ、必要となる消耗品の購入に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Increased L1 Retrotransposition in the Neuronal Genome in Schizophrenia. (2014)
  • 著者名/発表者名: Bundo M, Toyoshima M, Okada Y, Akamatsu W, Ueda J, Nemoto-Miyauchi T, Sunaga F, Toritsuka M, Ikawa D, Kakita A, Kato M, Kasai K, Kishimoto T, Nawa H, Okano H, Yoshikawa T, Kato T, Iwamoto K.
  • 雑誌名: Neuron 巻: 81 ページ: 306-313
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2013.10.053
  • 査読あり
• [雑誌論文] Involvement of Endoplasmic Reticulum Stress in Dysmyelination of Pelizaeus-Merzbacher Disease with PLP1 Missense Mutations Shown by Induced-Pluripotent-Stem Cell-Derived Oligodendrocytes (2014)
  • 著者名/発表者名: Numasawa-Kuroiwa Y, Okada Y, Shibata S, Kishi N, Akamatsu W, Shoji M, Nakanishi A, Oyama M, Osaka H, Inoue K, Takahashi K, Yamanaka S, Kosaki K, Takahashi T, Okano H
  • 雑誌名: Stem Cell Report 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enhanced aggregation of androgen receptor in induced pluripotent stem cell-derived neurons from spinal and bulbar muscular atrophy (2013)
  • 著者名/発表者名: Nihei Y, Ito D, Okada Y, Akamatsu W, Yagi T, Yoshizaki T, Okano H, Suzuki N.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 288 ページ: 8043-8052
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.408211
  • 査読あり
• [雑誌論文] A human Dravet syndrome model from patient induced pluripotent stem cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Higurashi N, Uchida T, Christoph L, Misumi Y, Okada Y, Akamatsu W, Imaizumi Y, Zhang B, Nabeshima K, Mori MX, Katsurabayashi S, Shirasaka Y, Okano H, Hirose S.
  • 雑誌名: Mol Brain 巻: 6 ページ: 19
  • DOI: 10.1186/1756-6606-6-19
  • 査読あり
• [雑誌論文] Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Okano H, Nakamura M, Yoshida K, Okada Y, Tsuji O, Nori S, Ikeda E, Yamanaka S, Miura K
  • 雑誌名: Circulation Research 巻: 112 ページ: 523-533
  • DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.111.256149
  • 査読あり
• [学会発表] Incompletely reprogrammed human iPSCs form glioma-like tumors through genomic instability during neural differentiation
  • 著者名/発表者名: Okada Y, Miya, F, Koike M, Tomisato S, Tokura T, Ishihara Y, Shimojo D, Hattori C, Kanematsu D, Kanemura Y, Kohda K, Sobue G, Yamanaka S, Yuzaki M, Uchiyama Y, Ikeda E, Tsunoda T, Okano H,
  • 学会等名: The 11th Stem Cell Research Symposium
  • 発表場所: Tokyo
  • 招待講演
• [学会発表] 不完全にリプログラミングされたヒトiPS細胞は分化誘導に伴うゲノム不安定化を通してグリオーマ様腫瘍を形成する
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平、宮冬樹、小池正人、冨里周太、戸倉智子、石原康晴、下門大祐、服部千夏、兼松大介、金村米博、幸田和久、祖父江元、山中伸弥、柚崎通介、内山安男、池田栄二、角田達彦、岡野栄之
  • 学会等名: 第36回日本神経科学大会、第56回日本神経化学会大会、第23回日本神経回路学会大会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] 多能性幹細胞(ES細胞/iPS細胞)の神経分化誘導とその応用
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: 第35回神経組織培養研究会
  • 発表場所: 大阪
  • 招待講演
• [学会発表] 培養皿の上で神経を作る―多能性幹細胞（ES細胞・iPS細胞）を用いた神経発生、神経再生、病態解析研究
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: 愛知医科大学先端医学研究センター 第13回研究セミナー
  • 発表場所: 愛知
  • 招待講演
• [学会発表] 多能性幹細胞を用いた神経疾患研究
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: ハンドフロンティア 第89回 前向き研究会
  • 発表場所: 名古屋
  • 招待講演
• [学会発表] iPS細胞を用いた神経疾患研究
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: 愛知医科大学加齢医科学研究所30周年記念講演会
  • 発表場所: 愛知
  • 招待講演
• [図書] 実験医学別冊「ES・iPS細胞実験スタンダード」 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平、岡野栄之
  • 総ページ数: 355
  • 出版者: 羊土社