• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2013 年度 実施状況報告書

光る透明ガエルの作出:非モデル両生類への遺伝子導入法の確立とNGSによる発現解析

研究課題

研究課題/領域番号 25640050
研究種目

挑戦的萌芽研究

研究機関広島大学

研究代表者

住田 正幸  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (10163057)

研究分担者 倉林 敦  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (00327701)
井川 武  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任助教 (00507197)
ISLAM Md.Mafizul  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任助教 (40598976)
中島 圭介  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (60260311)
研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード透明ガエル / 色彩突然変異 / 色素細胞 / 遺伝子導入 / 非モデル動物 / 光る透明ガエル / トランスクリプトーム解析
研究概要

1.透明ガエルの遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察:本研究では、ニホンアカガエルの灰色眼と黒色眼の2つの色彩突然変異を用いて、皮膚が透明で内臓が透けて見える透明ガエルを効率的に作製し、その遺伝様式を明らかにした。人工受精法により、透明ガエルの作製には灰色眼♀×野生型(ヘテロ)♂の交配が最も効率的であることが分かった。また、透明ガエルの皮膚の微細構造を調べるため、野生型、黒色眼、灰色眼および透明ガエルの真皮色素細胞を電子顕微鏡で観察した。その結果、野生型では黄色、虹色、黒色の3種類の色素細胞が層状に観察された。灰色眼には黄色素胞と虹色素胞が存在し、虹色素胞には異常な丸い反射小板が観察された。黒色眼には黄色素胞と黒色素胞が存在し、黄色素胞には未熟なプテリノソームやカロテノイド小胞が観察されたが、虹色素胞は観察されなかった。透明ガエルでは色素細胞の数が少なく、未熟な黄色素胞様の細胞が見られ、その中にはメラノソーム様の構造も観察された。2. 陸棲ガエルへの遺伝子導入法の確立:本研究では、ツメガエル類の遺伝子導入手法(Ogino et al.,2006)を陸上性のニホンアカガエルに適用するため、顕微注入法の条件検討を行った。検討の条件は、(1)卵ジェリーを取り除く溶液(チオグリコール酸ナトリウム)の濃度とpH、(2)インジェクション時の針の太さ、(3)インジェクション時のガス圧、(4)注入DNA、I-SceI(あるいは蛍光色素タンパク質mRNA:後述)の濃度と容量、(5)インジェクション時とその後の受精卵維持水の水質と至適温度、の5点である。インジェクション効率および遺伝子導入効率の測定には、赤色蛍光タンパク質mcherry mRNAとCMVプロモーター連結EGFP/I-SceIベクターを用いた。まだ、予備実験の段階であるが、受精卵に顕微注入した2日後のmcherry発現胞胚が得られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ニホンアカガエル皮膚mRNAの網羅的解析(トランスクリプトーム解析)を、計画通り行なうことができなかった。

今後の研究の推進方策

1.組織・器官特異的に光る透明ガエルの作成-昨年度の実験で得られた顕微注入最適条件下で、I-SceIエンドヌクレアーゼを用いた組織特異的プロモーター/蛍光タンパク質の導入を実施し、トランスジェニック透明ガエルを作成する。なお、ニホンアカガエル受精卵から成体までの飼育方法は申請者らが確立している(Sumida 1996; J. Herpetol. 30:333-346など)。
2. ニホンアカガエル皮膚mRNAの網羅的解析:昨年度計画してできなかった実験であるが、今年度は、ニホンアカガエル野生型および透明ガエルの変態期前後の皮膚(皮膚に色がつきはじめる時期)からmRNAを抽出し、完全長cDNAを合成する。cDNAをロングリード型次世代シークエンサー(GS-FLX+あるいはGS-junior:ロシュ社)でショットガンシークエンスする。ここで得たcDNA配列をネッタイツメガエルや、メダカ、マウス、ヒトゲノム情報と比較し、ニホンアカガエル変態期皮膚で発現している遺伝子とその配列を明らかにする。野生型と透明ガエルで得られた各相同遺伝子の配列を比較し、透明ガエルで機能が欠けている可能性のある(フレームシフト・アミノ酸欠失・置換が生じている)遺伝子リストアップする。それらの中で、他の動物で色素細胞の分化や色素合成・運搬に関わっていると考えられる遺伝子を、透明ガエルの黒色・虹色素胞異常の原因遺伝子候補とする。

次年度の研究費の使用計画

ニホンアカガエル皮膚mRNAの網羅的解析(トランスクリプトーム解析)を、計画通り行なうことができなかった。この予算(次世代シークエンサーによるシークエンスにかかる費用)を今年度に繰り越したため、次年度使用額が生じた。
今年度は、ニホンアカガエル野生型および透明ガエルの変態期前後の皮膚からmRNAを抽出し、完全長cDNAを合成し、cDNAをロングリード型次世代シークエンサー(GS-FLX+あるいはGS-junior:ロシュ社)でショットガンシークエンスする。上に記載した通り、この解析には、外注費として支出する予定である。ここで得たcDNA配列をネッタイツメガエルや、メダカ、マウス、ヒトゲノム情報と比較し、ニホンアカガエル変態期皮膚で発現している遺伝子とその配列を明らかにする予定である。

  • 研究成果

    (37件)

すべて 2014 2013 その他

すべて 雑誌論文 (8件) (うち査読あり 8件) 学会発表 (28件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Genetic divergences of South and Southeast Asian frogs: A case study of several taxa based on 16S ribosomal RNA gene data with notes on the generic name Fejervarya2014

    • 著者名/発表者名
      Hasan, M., M. M. Islam, M. M. R. Khan, T. Igawa, M. S. Alam, T. H. Djong, N. Kurniawan, H. Joshy, H. S. Yong, Daicus, M. B., A. Kurabayashi, M. Kuramoto and M. Sumida
    • 雑誌名

      Turk. J. Zool.

      巻: 38 ページ: in press

    • DOI

      doi: 10.3906/zoo-1308-36

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Improved transport of the model amphibian, Xenopus tropicalis, and its viable temperature for transport2014

    • 著者名/発表者名
      Kurabayashi, A., R. Kakehashi, I. Tazawa, Y. Haramoto, T. Oshima, Y. Ito and M. Sumida
    • 雑誌名

      Curr. Herpetol.

      巻: 33 ページ: 75-87

    • DOI

      doi:10.5358/hsj.33.75

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Development and characterization of 14 microsatellite markers for Buergeria japonica (Amphibia, Anura, Rhacophoridae)2014

    • 著者名/発表者名
      Komaki, S., T. Igawa, M. Nozawa, S.-M. Lin, S. Oumi and M. Sumida
    • 雑誌名

      Genes Genet. Syst.

      巻: 89 ページ: 35-39

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Mitochondrial genomes of Japanese Babina frogs (Ranidae, Anura): unique gene arrangements and the phylogenetic position of genus Babina2013

    • 著者名/発表者名
      Kakehashi, R., A. Kurabayashi, S. Oumi, S. Katsuren, M. Hoso and M. Sumida
    • 雑誌名

      Genes Genet. Syst.

      巻: 88 ページ: 59-67

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Development and characterization of new microsatellite loci in the Otton frog (Babina subaspera) and cross-amplification in a congeneric species, Holst’s frog (B. holsti)2013

    • 著者名/発表者名
      Kakehashi, R., T. Igawa, N. Iwai, E. Shoda-Kagaya, and M. Sumida
    • 雑誌名

      Conser. Genet. Res.

      巻: 5 ページ: 1071-7073

    • DOI

      doi:10.1007/s12686-013-9981-x

    • 査読あり
  • [雑誌論文] An attempt at captive breeding of an endangered newt, Echinotriton andersoni, from the Central Ryukyus in Japan2013

    • 著者名/発表者名
      Igawa, T., H. Sugawara, M. Tado, T. Nishitani, A. Kurabayashi, M. M. Islam, S. Oumi, S. Katsuren, T. Fujii and M. Sumida
    • 雑誌名

      Animals

      巻: 3 ページ: 680-692

    • DOI

      doi:10.3390/ani3030680

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Description of two new species of Microhyla (Anura: Microhylidae) from Bangladesh2013

    • 著者名/発表者名
      Hasan, M., M. M. Islam, M. Kuramoto, A. Kurabayashi and M. Sumida
    • 雑誌名

      Zootaxa

      巻: 3755 ページ: 401-418

    • DOI

      doi: 10.11646/zootaxa.3755.5.1

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Afrobatrachian mitochondrial genomes: genome reorganization, gene rearrangement mechanisms, and evolutionary trends of duplicated and rearranged genes2013

    • 著者名/発表者名
      Kurabayashi, A. and M. Sumida
    • 雑誌名

      BMC Genomics

      巻: 14 ページ: 633

    • DOI

      doi:10.1186/1471-2164-14-633

    • 査読あり
  • [学会発表] Evolutionary relationships and postmating isolation among Fejervarya species from Lesser Sunda, Indonesia and other Asian countries revealed by mtDNA Cyt b gene sequences and crossing experiments2014

    • 著者名/発表者名
      Hasan, M., N. Kurniawan, A. Soewondo, M. M. Islam, T. Igawa, W. M. M. Nalley, M. Matsui and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Artificial Breeding of an Indian Bullfrog (Hoplobatrachus tigerinus): A Case Study on Reproduction and Conservation2014

    • 著者名/発表者名
      Alam, M. S., M. M. R. Khan, M. M. Islam, M. Hasan and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Translucent frogs created through crossbreeding, and their inheritance and dermal chromatophore structure2014

    • 著者名/発表者名
      Sumida, M., M. M. Islam, T. Igawa, A. Kurabayashi, Y. Furukawa, N. Sano, T. Fujii and N. Yoshizaki
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Inter- and intra-island divergence in Odorrana ishikawae (Anura, Ranidae) of the Ryukyu Archipelago of Japan, with description of a new species2014

    • 著者名/発表者名
      Kuramoto, M., N. Satou, S. Oumi, A. Kurabayashi, and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] A new species of the Fejervarya limnocharis complex from Japan (Anura, Dicroglossidae)2014

    • 著者名/発表者名
      Djong, H. T., M. Matsui, M. Kuramoto, M. Nishioka, and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Development and characterization of 27 new microsatellite markers of Indian Bullfrog, Hoplobatrachus tigerinus (Daudin, 1802) and its congeneric species2014

    • 著者名/発表者名
      Sultana, N., T. Igawa, M. Nozawa, M. M. Islam, M. M. R. Khan, M. Hasan, M. S. Alam and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Inbreeding coefficient and genetic relationship of seven strains of Xenopus tropicalis inferred from genome wide genotyping of 54 microsatellite loci2014

    • 著者名/発表者名
      Watanabe, A., T. Igawa, A. Kashiwagi, A. Suzuki, A. Kurabayashi, T. Fujii, and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Genetic population structure of an endangered frog species, Babina holsti2014

    • 著者名/発表者名
      Kakehashi, R., T. Igawa and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] New insights into evolutionary history among Asian pond frog species2014

    • 著者名/発表者名
      Komaki, S., T. Igawa, K. Tojo, A. Kurabayashi, S.-M. Lin, M.-S. Min, and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Molecular cytogenetic studies on the process of genomic and chromosomal evolution in Xenopus laevis after WGD and the origin and evolution of sex chromosomes in anuran species2014

    • 著者名/発表者名
      Uno, Y., C. Nishida, C. Takagi, T. Igawa, N. Ueno, M. Sumida and Y. Matsuda
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] Discovery and phylogenetic distribution of a short interspersed nuclear element (SINE) subgroup in neobatrachian frogs2014

    • 著者名/発表者名
      Kurabayashi, A., N. Furuno, M. Sumida, H. Mizuno, K. Ohshima, and M. Vences
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 年月日
      20140327-20140328
  • [学会発表] カエル亜目におけるSINE(short interspersed nuclear elements)の発見と系統分布2013

    • 著者名/発表者名
      倉林敦・古野伸明・住田正幸・水野英明・大島一彦・M. Vences
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
    • 年月日
      20131102-20131103
  • [学会発表] Evolutionary relationships and postmating isolation among Fejervarya species from Lesser Sunda, Indonesia and other Asian countries revealed by mtDNA Cyt b gene sequences and crossing experiments2013

    • 著者名/発表者名
      Hasan, M., N. Kurniawan, A. Soewondo, M. M. Islam, T. Igawa, W. M. M. Nalley, M. Matsui and M. Sumida
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
    • 年月日
      20131102-20131103
  • [学会発表] 両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による保全の試み

    • 著者名/発表者名
      住田正幸・井川武・Islam M. M.・倉林敦・Alam, M. S.・掛橋竜祐・田戸美雪・新谷望・菅原弘貴・西谷琢磨・大海昌平・勝連盛輝・藤井保
    • 学会等名
      日本遺伝学会第85回大会
    • 発表場所
      慶応大学、横浜
  • [学会発表] Description of two new species of Microhyla (Anura: Microhylidae) from Bangladesh

    • 著者名/発表者名
      Hasan, M., M. M. Islam, M. Kuramoto, A. Kurabayashi and M. Sumida
    • 学会等名
      日本遺伝学会第85回大会
    • 発表場所
      慶応大学、横浜
  • [学会発表] Genetic divergence and postmating isolation between endangered Holst’s frog and Otton frog from the Ryukyu Archipelago, Japan, elucidated by allozyme and mitochondrial gene sequence analyses, crossing experiments and cytological observations

    • 著者名/発表者名
      Islam, M. M., R. Kakehashi, H. Koide, A. Kurabayasi, S. Oumi, S. Katsuren, T. Fujii, and M. Sumida
    • 学会等名
      日本遺伝学会第85回大会
    • 発表場所
      慶応大学、横浜
  • [学会発表] アフリカツメガエルのゲノム倍数化過程に生じた染色体再配列と無尾両生類における性染色体の起源とその進化に関する分子細胞遺伝学的研究

    • 著者名/発表者名
      宇野好宣・西田千鶴子・高木知世・井川武・上野直人・住田正幸・松田洋一
    • 学会等名
      日本遺伝学会第85回大会
    • 発表場所
      慶応大学、横浜
  • [学会発表] 絶滅危惧種イボイモリの遺伝的多様性と飼育下繁殖

    • 著者名/発表者名
      住田正幸・井川武・菅原弘貴・田戸美雪・西谷琢磨・倉林敦・Islam M. M.・大海昌平・勝連盛輝・藤井保
    • 学会等名
      日本動物学会第84回大会
    • 発表場所
      岡山大学、岡山市
  • [学会発表] 東アジア産トノサマガエル種群の系統関係と遺伝子浸透

    • 著者名/発表者名
      小巻翔平・井川武・倉林敦・Mi-Sook Min・Si-Min Lin・住田正幸
    • 学会等名
      日本動物学会第84回大会
    • 発表場所
      岡山大学、岡山市
  • [学会発表] 透明ガエルの遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察

    • 著者名/発表者名
      住田正幸・M. M. Islam・井川 武・倉林 敦・古川友加里・佐野尚美・藤井 保・吉崎範夫
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
  • [学会発表] Genetic divergence and postmating isolation among several brown frog species from Honshu and Ryukyu of Japan, and Mongolia elucidated by mitochondrial gene sequence analyses, crossing experiments and subsequent cytological observations of their hybrids and controls

    • 著者名/発表者名
      Islam, M. M., S. Oumi, H. Ida and M. Sumida
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
  • [学会発表] 絶滅危惧種ホルストガエルにおける遺伝的集団構造

    • 著者名/発表者名
      掛橋竜祐・井川武・住田正幸
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
  • [学会発表] Ion Torrent PGM を用いたハナサキガエルにおけるマイクロサテライト遺伝子座の単離と集団構造解析

    • 著者名/発表者名
      井川 武・長岡麻衣・野澤昌文・小巻翔平・藤井 保・住田正幸
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
  • [学会発表] 両生類モデル動物ネッタイツメガエル6系統における近交度及び遺伝的関係の解明

    • 著者名/発表者名
      渡辺愛・井川武・鈴木厚・柏木昭彦・倉林敦・藤井 保・住田正幸
    • 学会等名
      日本爬虫両棲類学会第52回大会
    • 発表場所
      東海大学、札幌
  • [学会発表] Captive breeding of endangered amphibian species: A case study of ex situ conservation

    • 著者名/発表者名
      Sumida, M., T. Igawa, M. M. Islam, A. Kurabayashi, M. S. Alam, R. Kakehashi, M. Tado, N. Shintani, H. Sugawara, T. Nishitani, S. Oumi, S. Katsuren, and T. Fujii
    • 学会等名
      50th Anniversary Meeting of the Australian Society of Herpetologists
    • 発表場所
      Greenhills Conference Centre, Canberra Australia
  • [学会発表] Description of two new species of Microhyla (Anura: Microhylidae) from Bangladesh

    • 著者名/発表者名
      Hasan, M., M. M. Islam, M. Kuramoto, A. Kurabayashi and M. Sumida
    • 学会等名
      50th Anniversary Meeting of the Australian Society of Herpetologists
    • 発表場所
      Greenhills Conference Centre, Canberra Australia
  • [学会発表] A case study of fauna conservation in Japan: Current conservation measures of wild populations, captive breeding, genetic diversity, and potential resource materials in the endangered frog species Odorrana ishikawae and O. splendida

    • 著者名/発表者名
      Sumida, M., M. M. Islam, T. Igawa, A. Kurabayashi, N. Satou, K. Ukena, S. Oumi, S. Katsuren, and T. Fujii
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
    • 招待講演
  • [学会発表] An ex situ conservation effort for several endangered and near-threaten amphibian species from the Ryukyu Archipelago, Japan: Captive breeding of nine anuran species and cryopreservation of sperm for two of them

    • 著者名/発表者名
      Islam, M. M., T. Igawa, A. Kurabayashi, R. Kakehashi, N. Satou, N. Shintani, M. Tado, H. Sugawara, T. Nishitani, M. Uchida, S. Oumi, S. Katsuren, T. Fujii, and M. Sumida
    • 学会等名
      International Symposium “Frontiers in Amphibian Biology”
    • 発表場所
      Hiroshima University, Higashihiroshima
  • [備考] http://home.hiroshima-u.ac.jp/~amphibia/sumida/

URL: 

公開日: 2015-05-28  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi