| 研究課題/領域番号 |
25640056
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
原口 清輝 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産草地研究所家畜育種繁殖研究領域, 主任研究員 (10324576)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 異種間キメラ / ニワトリ / ブタ / マウス / ES細胞 |
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| 研究概要 |
ブタは家畜であるのみならず、移植・再生医療の研究分野では欠くことの出来ない実験動物に位置づけられている。本研究は、申請者らが樹立したブタES様細胞を用い、マウス胚およびニワトリ胚を宿主に集合胚を作製した後、異種間キメラの作製を行う。これにより、異種間キメラを利用した幹細胞の多分化能評価システムの開発と、新たな実験モデルの創成を目指す。H25年度は、ブタES様細胞にEF1α-EGFP（ブタES-EGFP）およびEF1α-LacZ（ブタES-LacZ）発現ベクターを導入し、安定発現細胞株を樹立した。これらを用いて以下の実験を行った。
ブタ－マウスキメラ胚（in vitro）：ブタES-EGFP（5-10細胞）とマウス8細胞期胚で集合胚を作製した後培養すると、マウス胚盤胞内部細胞塊にブタES-EGFP由来の蛍光が確認された。さらに3日間out-growth培養を行った結果、内部細胞塊由来細胞集団にも蛍光が確認された為ブタES-EGFPがマウス胚組織に寄与できることが示唆された。
ブタ－ニワトリキメラ胚（ex ovo）：まずは条件検討のため、マウスES細胞（マウスES-LacZ）を放卵直後の胚盤葉にインジェクションし、3-5日後に胚を回収してLacZ染色を行った。その結果、インジェクションされる細胞数は多いほどキメラ率が高く（3×10^4 > 1×10^4）、注入量は少ないほど胚発生率が高いことが分かった（0.5 μl > 1.0 μl）。次に、1.5×10^4細胞（0.5 μl）のブタES-LacZをインジェクションし同様に解析を行ったところ、ニワトリ胚組織に分布するブタES様細胞集団を確認することが出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
レポーター遺伝子安定発現細胞株（ブタES-EGFP、ブタES-LacZ）は、カセットベクターにネオマイシン耐性遺伝子がセットになっているため、ネオマイシン類似体であるG418による薬剤選別により安定株の樹立が可能である。しかし実際は、G418耐性であるにもかかわらずGFPやLacZが発現しない細胞株が圧倒的に多く、安定株を樹立するまでにおよそ半年を費やすこととなった。安定株樹立後は、「研究実績の概要」に記述したとおり、H25年度の研究計画はほぼ達成できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ニワトリ胚は、発生ステージが進むにつれて内在性のβガラクトシダーゼ活性と自家蛍光が強まるため、発生初期（3日胚－5日胚）におけるキメラ解析を行った。より詳細なキメラ解析を行うためには、器官形成期（6日胚以降）における解析を行う必要がある。次年度は、脂溶性カルボシアニン色素（DiI等）で細胞表面をラベルしたものを使用する予定である。強力な蛍光が期待されるDiIで大まかなキメラ部位を特定した後組織切片を作製し、LacZ染色による詳細な解析を行う。また、ブタ－マウスキメラ胚をin vivoで解析するため、集合胚を作製した後胚移植し、発生後期で回収し解析する。
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